Секвенаторы ДНК 2-го поколения NGS

NGS-секвенаторы (секвенаторы 2 поколения, секвенаторы нового поколения) — современные высокопроизводительные автоматические устройства, предназначенные для быстрого и качественного определения первичной последовательности нуклеиновых кислот методами NGS-секвенирования (next generation sequencing). Дальнейшее развитие технологий секвенирования реализуется в нанопоровых секвенаторах 3 поколения.

Технологии секвенирования 2 поколения

Определение последовательности нуклеиновых кислот методами высокопроизводительного секвенирования представляет собой одновременное (параллельное) прочтение последовательности нескольких миллионов разных (относительно коротких) фрагментов исходной ДНК.

Достоинства NGS: высокая производительность, низкая стоимость на один нуклеотид, возможность таргетного, экзомного или полногеномного исследования, возможность секвенирования без каких-либо априорных знаний о последовательности ДНК.

Недостатки NGS: высокая стоимость некоторых реагентов, большая длительность прогона (некоторые модели), ошибки в GC-богатых участках (решается ресеквенированием методом Сэнгера), сложная обработка полученных данных, ограниченные возможности выявления крупных делеций, инсерций, транслокаций (решается методом сравнительной геномной гибридизации).

Основные современные технологии NGS

Существует несколько методов NGS различных по принципам секвенирования, но так или иначе любой способ начинается с приготовления библиотеки ДНК (определяет 90% успеха секвенирования). Наиболее популярные сейчас технологии NGS не позволяют читать непосредственно геномную или кДНК и предполагают амплификацию исходных молекул. Образец ДНК, определенным образом фрагментированный и амплифицированный, называется библиотекой случайных фрагментов ДНК для NGS.

Подготовка библиотеки обычно включает следующие этапы: выделение и очистка ДНК/РНК — количественная оценка (с использованием флуориметра, наноспектрофотометра либо ПЦР в реальном времени, цифровой ПЦР) — фрагментирование (нарезка на фрагменты определенной длины путем расщепления ультразвуком или ферментами) - оценка качества фрагментированной ДНК (оценка длин фрагментированной ДНК обычно проводится с использованием систем капиллярного электрофореза на чипе, кроме оценки степени разрушения исходной ДНК это же оборудование можно использовать для выявления димеров, праймеров и не сработавших адаптеров, а также определения размеров полученной библиотеки) — предварительная амплификация библиотеки (не более 13-15 циклов, требуется в том случае, если количество исходной ДНК гораздо ниже рекомендуемого) — отбор фрагментов нужной длины (необходим для повышения качества секвенирования, наилучшим решением на этом этапе является использование специальных систем препаративного электрофореза) — лигирование адаптеров — клональная амплификация (мостиковая или эмульсионная ПЦР). Приготовление библиотек возможно вручную либо автоматизированно.

Секвенирование синтезом (технология «Solexa») — секвенирование осуществляется с использованием четырех меченых разными флуорофорами нуклеотидов, 3′-конец которых заблокирован (обратимые терминаторы), что не позволяет включать ДНК-полимеразе в синтезируемую цепь более одного основания за цикл. Процесс секвенирования идет циклически, параллельно, на множестве чипов. Каждый цикл состоит из следующих этапов:

• внесение всех типов нуклеотидов в проточный чип с ПЦР-продуктами (после мостиковой ПЦР);
• включение ДНК-полимеразой одного меченого нуклеотида и вымывание остальных;
• детекция флуоресценции от каждого ПЦР-продукта;
• снятие 3′-блока вместе с флуорофором (промывка).

Полупроводниковое секвенирование (технология Ion Torrent) - секвенирование начинается с отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов библиотеки ДНК. Затем к синтезируемой цепи ДНК по очереди добавляют обычные трифосфаты (dNTP). Если добавленный нуклеотид оказывается комплементарен матрице, ДНК-полимераза встраивает его в цепь, при этом выделяется протон (H⁺), вызывающий изменение pH раствора, которое детектируется. Если нуклеотид не подходит, сигнал отсутствует. После каждого добавленного в реакцию нуклеотида прибор выполняет промывку системы для очистки от остатков, не включившихся dNTP данного типа. В настоящее время в Ion Torrent устранены трудности с детекцией гомополимерных участков (ослабление дискретности сигнала в случае протяженного мононуклеотида, например TTTTTTT, в связи с чем становится сложно определить, сколько именно нуклеотидов (5, 6 или 7) присутствует в последовательности). Важным отличием полупроводникового секвенирования от других популярных методов является отсутствие оптического детектора сигнала, что значительно упрощает и удешевляет конструкцию прибора.

Пиросеквенирование — регистрация акта присоединения нуклеотида по образующемуся пирофосфату. Метод основан на синтезе новой ДНК-цепи на иммобилизированной анализируемой ДНК-матрице с участием ДНК-полимеразы в присутствии праймера при последовательном добавлении каждого из dNTP. При встраивании нуклеотида стехиометрически высвобождается пирофосфат (PPi). Он активирует каскад химических реакций, в результате возникает световой сигнал, интенсивность которого прямо пропорциональна числу включенных в цепь нуклеотидов (если подряд идут несколько одинаковых нуклеотидов, сигнал будет ярче). Свет регистрируется камерой и далее анализируется компьютерной программой. Невстроенные нуклеотиды подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом. Серьезной проблемой метода являются трудности с детекцией гомополимерных участков.

Другие технологии NGS (в настоящее время мало распространены)

• 454 Life Sciences (один из вариантов пиросеквенирования);
• секвенирование лигированием (технология SOLID).

Области применения NGS-секвенирования

Области применения NGS-секвенирования: секвенирование геномов de novo; идентификация бактерий и патогенных грибов; выявление и подтверждение мутаций; выявление и подтверждение гетерозиготности; выявление и подтверждение SNPs; сравнительное секвенирование; HLA-типирование; генотипирование ВИЧ для идентификации мутаций устойчивости к лекарственным препаратам; онкогенетика, популяционная и географическая генетика (миграции генов в популяциях), идентификация личности по SNP-маркерам; молекулярная филогенетика (систематика живых организмов) и др.

Критерии выбора NGS-секвенатора

• Максимальная производительность (от 1 гигабазы у небольших приборов до 100-120 гигабаз у самых высокопроизводительных);
• постоянная или переменная производительность (возможность использования чипов разной производительности на одном приборе);
• способ подготовки библиотек - ручной или автоматизированный (незаменим при большом потоке образцов);
• время, необходимое на 1 запуск (от нескольких часов до двух суток);
• длина прочтений: более короткие чтения (до 200 п.н.) позволяют работать с деградированной ДНК, но сборка генома из них сложнее чем из более длинных прочтений (400-600 п.н.);
• количество прочтений за запуск (от нескольких миллионов до сотен миллионов);
• точность прочтений.

Наличие Регистрационного удостоверения РосЗдравНадзора уточняйте у специалистов Диаэм.