BluePippin — система
препаративного электрофореза и
пульс-электрофореза, позволяет разделять и выделять фрагменты НК, размером 90-50000 п.н., а так же белки массой 18-200 кДа.
- Одновременный прогон до 5 образцов;
-
напряжение при электрофорезе, В — 25, 100 и 150 (постоянный ток), или 100 в режиме пульс-электрофореза;
-
ток (на каждую дорожку), мА — 2 или 3;
-
длина волны возбуждения, нм — 470;
-
длина детекции, нм — 525;
-
максимальная нагрузка фрагментированной геномной ДНК на дорожку, мкг — 5;
-
минимальная нагрузка фрагментированной геномной ДНК на дорожку, нг — 15;
-
размер ДНК - 100 bp - 50 kb;
-
точность выделения, % - > 93;
-
воспроизводимость выделения, % - > 92;
-
минимальное распределение по размерам, % - 8;
-
выход образца, % - 50-80;
-
габариты, ШхГхВ, см — 28х53х18;
-
вес, кг — 7.
Области применения:
Принцип работы: в системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК-маркера.
4 режима программирования:
- Tight (узкий) – сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров.
- Range (диапазон) – пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
- Time (время) – коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
- Peak (пик) – сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).
3 стратегии детектирования фракций:
- Для ДНК малых размеров (90 п.н. -1,5 тыс.п.н.):
Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые маркеры ДНК, определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.
- Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п.н.):
Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый маркер ДНК определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
- Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п.н.):
Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
Преимущества метода:
- Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов.
- Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования.
- Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации.
- Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов.
- Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.
Схема работы:
- Пробоподготовка:
- Подготовка материала, если используются внутренние стандарты: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл флуоресцентно - меченного маркера.
- Подготовка материала, если используется внешний стандарт: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл загрузочного раствора. 40 мкл готового стандарта помещается в отдельную дорожку.
- В случае с красителем Midori Green, 40 мкл красителя помещается в каждую из пяти + буферную камеру и при включении тока будет двигаться на встречу образцам.
- Эксперимент:
- Выбираем картридж в соответствии со стратегией, с помощью которой будет производиться детектирование НК;
- помещаем картридж в прибор и выбираем её в ПО из списка предложенных программой (ПО само установит все необходимые параметры для проведения электрофореза под выбранный картридж);
- По истечении времени, заданного программой, образец аккуратно собираем из коллектора фракций пипеточным дозатором.
Информация о свежих статьях:
1. Nature Methods. Assembly and diploid architecture of an individual human genome via single-molecule technologies (июнь, 2015); Authors: Matthew Pendleton, Robert Sebra, Andy Wing Chun Pang, Ajay Ummat et al.
2. BioTechniques. Optimization and cost-saving in tagmentation-based mate-pair library preparation and sequencing. (май, 2015) DOI:10.1038/nmeth.3454; Authors: Kaori Tatsumi, Osamu Nishimura, Kazu Itomi, Chiharu Tanegashima, and Shigehiro Kuraku.
Видео:
Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep
Для проведения пульс-электрофореза применяется специальный источник питания Pippin Pulse.
