Проточные цитометры: анализаторы и сортеры

Проточные цитофлуориметры (цитометры) — высокопроизводительные системы анализа частиц (как правило, клеток) в потоке жидкости. Анализ частиц ведется с большой скоростью (до десятков тысяч в секунду), причем каждая частица анализируется отдельно. Метод проточной цитометрии позволяет получать за короткое время качественные и количественные данные по анализируемым частицам с высокой статистической достоверностью.

Проточные цитометры используются для широкого круга задач, связанных с анализом клеток, таких как подсчет клеток, иммунофенотипирование (в иммунологии, гематологии, онкологии, при культивировании клеток и пр.), клеточный цикл и пролиферация, клеточное здоровье и апоптоз, автофагия, клеточный сигналинг, токсикология, эффективность трансфекции и т.д. Типичные объекты — клетки человека и животных, клетки растений и микроводоросли, дрожжи, бактерии, микрочастицы и экзосомы.
CD3.png Viability.png Leuko_.png
Центральным элементом проточного цитометра является проточная ячейка, в которой клетки выстраиваются друг за другом в ламинарном потоке жидкости и проходят через луч лазера. Лазерный луч, проходя через клетку, отклоняется, рассеивается и вызывает флуоресценцию красителей, которыми маркируются исследуемые структуры. Отклоненный и рассеянный свет облучающего лазера, а также свет, полученный в результате флуоресценции, попадает на детекторы, переводится в цифровой сигнал, значение которого пропорционально интенсивности попавшего на детекторы света. Данные по интенсивности обрабатываются компьютером и выводятся в виде графиков и статистических характеристик.

Существует несколько типов проточных ячеек. Большинство проточных цитометров использует проточную ячейку с гидродинамической фокусировкой: ламинарный поток создается потоком обжимающей жидкости (sheath fluid), которая со всех сторон «обжимает» образец. Другой тип проточных ячеек использует капиллярные взаимодействия для создания ламинарного потока: образец подается в микрокапилляр или в чип, работающий по принципу микрофлюидики.
Scheme.png
Скорость, с которой клетки движутся в потоке, определяет время измерения: чем выше скорость, тем быстрее проходит измерение, но выше вариабельность результатов (часто выражается в виде коэффициента вариации, CV, coefficient of variation). Высокие значения CV могут затруднить разделение популяций клеток, усложнить трактовку результатов измерения. Для уменьшения CV при больших скоростях может применяться акустическая фокусировка клеток в потоке.

В качестве источника света в проточных цитометрах используются лазеры. Наиболее универсальный — голубой (длина волны 488 нм), широко распространены также красный (642 нм) и фиолетовый (405 нм) лазеры. Для решения специальных задач могут дополнительно устанавливаться лазеры с другими волнами излучения. От «цвета» лазера зависит выбор флуорохромов, которые можно использовать для окраски. Увеличение количества лазеров существенно расширяет этот выбор, позволяет подбирать более эффективные комбинации флуорохромов для характеристики клеток, увеличивать количество параметров клеток, которые можно проанализировать за одно измерение. В системах с несколькими лазерами свет, полученный при облучении клетки, может собираться для всех лазеров одновременно (коллинеарные системы) или для каждого лазера отдельно (например, при пространственном разделении точек облучения клеток каждым лазером). В последнем случае можно в рамках одного измерения использовать флуорохромы, имеющие сходный спектр эмиссии, если они различаются по спектру возбуждения.
FlowCell_trad.PNG FlowCell_capil.PNG acoustic_focusing.png

В качестве детекторов светового сигнала от клеток в традиционных проточных цитометрах используются PMT (photomultiplier tube, фотоумножители), которые представляют собой вакуумную лампу с двумя основными электродами (катод и анод) и несколькими промежуточными (диноды). Свет, полученный при облучении клеток, падает на фотоэлектрод PMT и выбивает из него электроны. Эти электроны летят к диноду и каждый из них выбивает еще несколько, которые летят к следующему диноду и т.д. Таким образом, PMT не только преобразует световой сигнал в электрический, но и значительно его усиливает. Благодаря своей чувствительности, PMT до сих остается самым распространенным детектором для проточных цитометров. Другой вариант детекторов — фотодиоды — все больше набирает популярность с развитием технологии их производства, повышением их чувствительности.

Lasers.png

PMT.jpg
Таким образом, фотоны света преобразуются в электрический импульс, величина которого пропорциональна попавшему на детектор свету. То есть, например, чем больше в клетке окрашенных структур, тем ярче она флуоресцирует, тем сильнее электрический сигнал, регистрируемый на детекторе. Детектор регистрирует весь свет, который на него попадает, поэтому для многоцветного анализа весь спектр, который приходит от клеток необходимо делить на узкие спектральные полоски при помощи серии фильтров, и каждый участок спектра попадает на отдельный детектор, соответствующий определенному «цвету».

В системах, использующих PMT или фотодиоды, анализируется общая интенсивность светового сигнала с каждой клетки, саму клетку, ее форму при этом увидеть невозможно. О том, что точка на графике — это именно исследуемая клетка, приходится догадываться с той или иной степенью вероятности (вместо термина «клетка» принято говорить «событие»). Проблема верификации выделенных популяций «событий» стоит остро и решается дополнительными процедурами анализа, контролями, привлечением клеточного сортинга с последующей микроскопией. Удачным сочетанием наглядности микроскопии и скорости проточной цитометрии стали визуализирующие проточные цитометры (Imaging Flow Cytometers). В качестве детектора в них используется CCD-камера. Хотя чувствительность CCD-матрицы ниже, чем PMT, ее можно значительно усилить. Так, технология TDI (time delay integration, накопление сигнала во времени) предусматривает электронное сопровождение движущихся объектов (клеток). Скорость «перемещения» засвеченных пикселей по матрице синхронизируется со скоростью клетки в потоке, собранные данные по интенсивности изображения на каждом участке матрицы накапливаются и собираются в одно изображение с повышенной яркостью и четкостью. В результате, такие системы обладают чувствительностью, не уступающей и даже превышающей чувствительность PMT. Визуализация любого события обеспечивает верификацию без дополнительных ухищрений и позволяет исследовать популяции, которые в традиционной цитометрии отбрасываются. Каждой точке на графике в визуализирующей проточной цитометрии соответствует изображение, на котором можно проследить не только наличие или отсутствие определенной структуры, но и подсчитать количество этих структур, локализацию в клетке, качественно и количественно оценить морфологию клеток.
Amnis_scheme.jpg Amnis_TDI.png Amnis_dots_images.PNG sorter.PNG

По возможности отделить нужную популяцию от остальных клеток проточные цитометры делят на анализаторы (только логическое выделение) и сортеры (логическое и физическое выделение нужных клеток). Клеточные сортеры способны провести анализ, выбрать нужную популяцию и выделить ее в отдельную пробирку, лунку планшета или перенести на предметное стекло. Для разделения клеток большинство сортеров использует электростатическую сепарацию. После прохождения через луч лазера (т.е. после анализа) клетка изолируется в капле жидкости. В зависимости от результатов анализа капля с клеткой получает определенный электрический заряд, благодаря которому она отклоняется в электромагнитном поле и, в итоге, оказывается в пробирке с такими же клетками. Капли, не получившие заряд, попадают в слив и удаляются. В некоторых сортерах сортировка производится при помощи чипов на основе микрофлюидики.

Существуют также другие методы сортировки клеток: при помощи магнитной сепарации (MACS, magnetic-activated cell sorting), при помощи микропузырьков (BACS, buoyancy activated cell sorting), сортировка единичных клеток при помощи микрочипов.

Проточные цитометры придуманы и используются для анализа дискретных частиц: клеток животных и человека, растительных клеток, водорослей, грибов, микроорганизмов. Исследуемые структуры или вещества должны быть расположены на поверхности или внутри этих частиц. Однако существуют также приложения для исследования растворенных веществ — то, чем традиционно занимается ИФА. Для детекции на проточном цитометре растворенных аналитов их нужно связать с частицами, которые сможет «увидеть» проточный цитометр. В качестве таких частиц используют бидсы (beads) — полимерные микросферы, сопоставимые по размеру с клетками (5-15 мкм), с которыми прочно связывают (иммобилизируют) антитела к исследуемому аналиту. В растворе молекулы аналита связываются с нанесенными на бидсы антителами, далее аналит дополнительно метят флуоресцентным красителем (также при помощи антител). По яркости флуоресценции этого красителя судят о концентрации аналита в растворе. Развитие этого метода привело к созданию мультиплексных анализаторов.

По спектру решаемых задач можно разделить проточные цитометры на открытые и закрытые. В открытых системах (большинство проточных цитометров) задачи и способ их решения определяются пользователем и ограничены только возможностями прибора и фантазией исследователя. Закрытые системы ориентированы на решение специализированных задач (одной или нескольких), методы анализа и, зачастую, реагенты определяются производителем этих приборов. Преимущества таких приборов – простота в использовании, минимальная необходимость оптимизации метода, зачастую меньшая цена, чем у открытых систем.

При выборе проточного цитометра стоит обращать внимание на следующие факторы:
  • какие наиболее типичные измерения, какие цветовые комбинации будут использоваться, какие характеристики прибора должны быть для проведения измерений: количество лазеров, количество флуоресцентных параметров;
  • тип детекторов флуоресценции (возможность визуализации);
  • разрешающая способность — способность различать тускло окрашенные популяции;
  • скорость анализа (актуальна при анализе редких популяций), складывается из возможного количества событий в секунду и скорости потока;
  • точность измерения, коэффициент вариации (CV) — особенно актуально при анализе клеточного цикла;
  • минимальный размер анализируемых частиц (актуально для изучения микроорганизмов и микровезикул);
  • наличие автосэмплера для автоматического анализа из нескольких пробирок или лунок планшета существенно освобождает время исследователя.
multiplex.jpg

Специалист Диаэм по проточной цитометрии и мультиплексному анализу всегда поможет вам с подбором оптимальной модели.

Частично задачи можно решать на других приборах:

При работе с проточными цитометрами может понадобиться дополнительное оборудование: автоматические пипетки, микро- и миницентрифуги, вортексы, системы очистки воды.

Клеточные анализаторы Merсk (Millipore)

Развернуть описание # Muse
1 100 000,00 руб
Спеццена
Развернуть описание # Guava
по запросу
Развернуть описание # CellStream
по запросу
Развернуть описание # FlowSight
по запросу
Развернуть описание # ImageStreamX Mark II
по запросу

Клеточные анализаторы BD Biosciences

Развернуть описание # Accuri C6
по запросу
Развернуть описание # FACSCalibur
по запросу
Развернуть описание # FACSCanto II
по запросу
Развернуть описание # FACSVerse
по запросу

Клеточные анализаторы Beckman Coulter

Развернуть описание # CytoFLEX
по запросу

Клеточные анализаторы Thermo Fisher Scientific

Развернуть описание # Attune NxT
347 689,95 доллар

Клеточные анализаторы Bio-Rad

Развернуть описание # ZE5
по запросу

Сортеры клеток BD Biosciences

Развернуть описание # FACSCalibur_Sorter
по запросу
Развернуть описание # FACSAria III
по запросу

Сортеры клеток Beckman Coulter

Развернуть описание # MoFlo_Astrios_EQ
по запросу

Сортеры клеток Bio-Rad

Развернуть описание # S3e
по запросу

Другое лабораторное оборудование и принадлежности: co2 инкубатор, биохимический экспресс анализатор, весы аналитические лабораторные, встряхиватель лабораторный.