Проточные цитофлуориметры (цитометры) — высокопроизводительные системы анализа частиц (как правило, клеток) в потоке жидкости. Анализ частиц ведется с большой скоростью (до десятков тысяч в секунду), причем каждая частица анализируется отдельно. Метод проточной цитометрии позволяет получать за короткое время качественные и количественные данные по анализируемым частицам с высокой статистической достоверностью. Проточные цитометры используются для широкого круга задач, связанных с анализом клеток, таких как подсчет клеток, иммунофенотипирование (в иммунологии, гематологии, онкологии, при культивировании клеток и пр.), клеточный цикл и пролиферация, клеточное здоровье и апоптоз, автофагия, клеточный сигналинг, токсикология, эффективность трансфекции и т.д. Типичные объекты — клетки человека и животных, клетки растений и микроводоросли, дрожжи, бактерии, микрочастицы и экзосомы.
Muse — компактный клеточный анализатор, работающий по принципу проточной цитометрии для простого и недорого и быстрого анализа. Управление через сенсорный дисплей, интуитивное программное обеспечение, оптимизированные наборы реагентов формата «смешать и измерить» вместе обеспечивают существенное упрощение решения исследовательских задач.
Клеточный анализатор Muse обеспечивает прямое измерение концентрации клеток (без использования референсных частиц) и количественную детекцию флуоресцентных параметров. Оптимизированные наборы реагентов и адаптированные к ним модули программного обеспечения позволяют определять жизнеспособность клеток, апоптоз на разных этапах, исследовать пролиферацию и клеточный цикл, клеточный сигналинг, параметры иммунного статуса и др.
Analisys
Cell concentration
Viability
Average % CV
% CV Range
Average % CV
% CV Range
Image-based Automated Counter
9,2%
1,2-23,3%
3,7%
0,8-12,1%
Manual Hemocytometer
9,2%
6,3%
4,5%
0,5-9,2%
Muse
4%
0,3-8,8%
2,2%
0,4-5,6%
Преимущества системы:
компактность: можно поставить в любом месте;
легкость и простота использования: готовые наборы реагентов c упрощенной пробоподготовкой;
интуитивное управление: позволяет сделать работу максимально комфортной;
программные модули адаптированы под наборы реагентов: простой анализ образцов;
универсальность: два открытых программных модуля под реагенты пользователя;
возможность обслуживания без участия сервисного инженера.
Другие методы анализа
Muse
Счетные камеры (например, камера Горяева)
Ограничения в связи с низким разрешением поглощения красителя для определения жизнеспособности. Погрешности, связанные с ручным подсчетом.
Анализ Muse Count and Viability
Точный, основанный на флуоресцентном окрашивании метод определения живых и мертвых клеток. Микрокапиллярная флюидика для прямого подсчета концентрации с высокой точностью.
Автоматические гемоцитометры и клеточные анализаторы на основе светлопольной микроскопии
Низкая точность в результате анализа небольшого числа клеток, использование ограничено подсчетом концентрации и жизнеспособности.
Методы анализа Muse
Флуоресцентный сигнал на основе специфичного связывания реагентов с мишенями. Статистическая достоверность достигается измерением тысяч клеток за несколько минут.
Вестерн-блот и другие методы обобщенного анализа клеточной популяции
Гетерогенность популяции теряется при пулировании.
Методы времязатратные и требуют внешнего контроля.
Реагенты должны быть оптимизированы и валидированы.
Результаты качественные или, в лучшем случае, полуколичественные.
Методы анализа Muse
Результаты для популяции в каждом образце на основе анализа каждой клетки.
Очень простые методы пробоподготовки, дополнительно нужны только пипетки.
Реагенты оптимизированы и валидированы для использования на разных типах клеток.
Большие проточные цитометры
Реагенты должны быть валидированы.
Оптимизация требует затрат времени и ценного образца.
Нужна отдельная настройка установок прибора под каждую задачу.
Методы анализа Muse
Флуоресцентные реагенты уже подобраны под лазер и детекторы Muse, оптимизированы для разных типов клеток.
Валидированные методы анализа, оптимизированная пробоподготовка и предустановленные настройки прибора в программном обеспечении.
Уникальная особенность Attune NxT — функция акустической фокусировки, позволяющей проводить измерения с высокой скоростью без потери качества, сохраняя низкую вариабельность.
Возможности Attune NXT при анализе плоидности:
высокая скорость измерения с сохранением низких значений коэффициента вариации;
возможность использовать готовые реагенты Thermo FS для окраски ядер или использовать реагенты сторонних производителей;
отработанные протоколы для разных задач в анализе плоидности;
классический анализ плоидности при помощи голубого лазера (488 нм) и йодистого пропидия;
возможность установки дополнительных лазеров (можно докупать после покупки прибора);
легкая замена фильтров при необходимости их оптимизации;
возможность использовать опциональный автосэмплер и роботизированную подачу для автоматической смены образцов и ускорения производительности;
универсальность — при необходимости прибор можно использовать и для других задач в области проточной цитометрии.
Технические характеристики Attune NXT:
лазеры — 1 (488 нм, 50 мВт), возможен апгрейд на рабочем месте пользователя до 4х-лазерной конфигурации;
профиль лазера: 10 x 50 мкм, с плоской вершиной;
каналы детекции — FSC¹, SSC², 4 флуоресцентных (до 14 флуоресцентных параметров при покупке дополнительных лазеров);
чувствительность MESF³ — ≤ 80 MESF for FITC, ≤ 30 MESF for PE;
формат загрузки — пробирки размерами от 17 x 100 мм до 8,5 x 45 мм (включая стандартные пробирки на 1,5, 2 и 5 мл), опциональный автозагрузчик для 96- и 384-луночных планшетов;
скорость потока — 12,5-1000 мкл/мин;
скорость сбора данных — до 65 000 событий/сек;
метод определения концентрации частиц — прямой подсчет;
габариты, Ш × Г × В — 400 × 580 × 430 мм;
вес — 29 кг.
Предложение включает проточный цитофлуориметр Attune NxT, оснащенный лазером 488 нм и 4 детекторами флуоресценции, 1 год гарантии. В комплект поставки входит дополнительный фильтр 603/48, оптимизированный под флуоресценцию йодистого пропидия, и стартовый набор реагентов для запуска.
¹ forward scatter, прямое светорассеивание;
² side scatter, боковое светорассеивание;
³ molecules of equivalent soluble fluorochrome, число молекул эквивалентного растворимого флуорохрома.
Лекция, 60 мин. Analysis of Surface Antigens on Exosomes using the Invitrogen Attune NxT Flow Cytometer
Лекция, 45 мин. The Use of Flow Cytometry to Identify Cancer Stem Cells in Primary Tumors and in Circulation
Примеры статей с использованием проточного цитофлуориметра Attune NxT
1) An Advanced Protocol for the Quantification of Marine Sediment Viruses via Flow Cytometry Mara Elena Heinrichs, Daniele De Corte, Bert Engelen and Donald Pan.
Разработка протоколов для подсчета вирусных частиц с помощью проточной цитометрии Attune NxT в морских донных отложениях.
doi.org/10.3390/v13010102.
2) Control of Multigene Expression Stoichiometry in Mammalian Cells Using Synthetic PromotersYash D. Patel,Adam J. Brown, Jie Zhu, Guglielmo Rosignoli, Suzanne J. Gibson, Diane Hatton, David C. James.
Использование Attune NxT для контроля стехиометрии мультигенной экспрессии, с использованием синтетических промоторов в клетках млекопитающих.
doi: 10.1021/acssynbio.0c00643.
3) Immunomodulatory Responses of Two Synthetic Peptides against Salmonella Typhimurium Infection. Marco Antonio Ibarra-Valencia, Gerardo Pável Espino-Solis, Blanca Elisa Estrada and Gerardo Corzo.
Иммуномодулирующий потенциал синтетических антимикробных пептидов оценивали путем определения профилей экспрессии цитокинов с помощью проточного цитометра Attune NxT.
doi: 10.3390/molecules26185573.
4) ATP13A3 is a major component of the enigmatic mammalian polyamine transport system. Norin Nabil Hamouda, Chris Van den Haute, Roeland Vanhoutte, Ragna Sannerud, Mujahid Azfar, Rupert Mayer, Álvaro Cortés Calabuig, Johannes V Swinnen, Patrizia Agostinis, Veerle Baekelandt, Wim Annaert, Francis Impens, Steven H L Verhelst, Jan Eggermont, Shaun Martin, Peter Vangheluwe. Attune NxT использовался для изучения новых компонентов системы транспорта полиаминов через мембрану у млекопитающих.
doi: 10.1074/jbc.RA120.013908.
5) Microengineered perfusable 3D-bioprinted glioblastoma model for in vivo mimicry of tumor microenvironment. Lena Neufeld¹, Eilam Yeini¹, Noa Reisman¹, Yael Shtilerman¹, Dikla Ben-Shushan¹, Sabina Pozzi¹, Asaf Madi², Galia Tiram¹, Anat Eldar-Boock¹, Shiran Ferber¹, Rachel Grossman³, Zvi Ram³, Ronit Satchi-Fainaro¹ ⁴ *.
В лабораторных исследованиях многие лекарственный препараты показывают многообещающие результаты, но в конечном итоге не проходят клинические испытания. Современные модели рака неадекватны и это основная проблема. У большинства моделей отсутствует взаимодействие опухоль – строма, для правильного представления комплексной биологии рака. Гетерогенное микроокружение фибриновой глиобластомы, состоящей из клеток глиобластомы, астроцитов и микроглии, воспроизвели материалом полученным от пациентов. 3D-модель может стать основой для быстрого, воспроизводимого и надежного обнаружения цели, персонализированный скрининг, разработка лекарств, и потенциально заменить клеточные культуры и модели животных, в качестве мощной платформы.
Проточний цитофлуоримета Attune NxT использовался для оценки экспрессии Р-селектина в клетках, выращенных в 2D-культуре (2D culture) и в фибрине – 3D-бионик (fibrin 3D-bioink). С помощью проточного цитофлуориметра Attune NxT показан высокие уровни экспрессии P-селектина на клетках PD-GB4, выращенных в фибрине – 3D-бионик по сравнению с 2D культурой.
doi: 10.1126/sciadv.abi9119.
Простой, удобный в работе проточный цитофлуориметр 7S, от китайской компании BioSino, способен обеспечить до 95% потребностей клеточной лаборатории в области клеточного анализа. Прибор имеет один синий лазер (488 нм), но, несмотря на это, обеспечивает до 7 каналов флуоресцентной детекции и обладает высокой чувствительностью детекции и простым ПО, что делает получение результатов быстрым и максимально комфортным.
7S позволяет реализовать все базовые методы цитометрии в лаборатории: анализ клеточного апоптоза и аутофагии, оценка эффективности трансфекции и уровня экспрессии, изучить фенотипы и субпопуляции лимфоцитов, провести HLA-типирование или анализ индекса фрагментации ДНК спермы человека, а также изучить плоидность растений.
Цитофлуориметр 7S оснащен синим аргоновым лазером 488 нм (50 мВт) и системой детекции из 7 сверхчувствительных светодиодных детекторов, которые регистрируют 5 флуоресцентных сигналов, а также прямое (FSC*) и боковое светорассеяния (SSC**).
Система детекции позволяет работать как с самыми популярными красителями (FITC, Alexa 488, PE, PI), так и тандемными красителями (PE-Texas Red, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7), что позволяет реализовать простые мультиплексные эксперименты.
Демонстрация прибора
Прибор имеется на складе, есть возможность запросить демонстрацию на рабочем месте заказчика. Форма заказа доступна по кнопке «Заказать демо».
Технические характеристики цитофлуориметра 7S
Автоматический забор проб с функцией автоматического промешивания;
ПО на английском языке;
сбор данных / компенсация флуоресценции в 1 клик;
метод определения концентрации клеток – прямой подсчет;
источник возбуждения – синий лазер 488 нм;
каналы детекции:
FL1 – 525/50 нм (FITC/Alexa 488);
FL2 – 585/40 нм (PE);
FL3 – 630/30 нм (PE-Texas Red/ECD/PI);
FL4 – 697/60 нм (PerCP /PE-Cy5 / PE-Cy5.5);
FL5 – 780/60 нм (PE-Cy7);
FSC* чувствительность, мкм – менее 1;
минимальный объем образца, мкл – 90;
чувствительность, MESF*** – не более 150 (по FITC) и не более 50 (по PE);
коэффициенты вариации (CV) для всех каналов, % – менее 2;
Особенность всех проточных цитофлуориметров серии Guava easyCyte – проточная ячейка на основе запатентованной микрокапиллярной технологии. Использование микрокапиллярных взаимодействий для выравнивания клеток в потоке позволило отказаться от обжимающей жидкости и снизить количество отходов (до 50 мл за 8 часов работы).
Интуитивное программное обеспечение собирает и анализирует данные с помощью готовых программных модулей либо на основе настроек, самостоятельно оптимизированных пользователем для решения исследовательских задач.
Проточные цитометры Guava easyCyte компактны, экономичны и просты в работе и обслуживании. Микрокапиллярная проточная ячейка построена на основе кварцевого капилляра квадратного сечения со стороной 100 мкм, пригодна для работы с разным типом клеток, ее обслуживание (в том числе при забивке) проводится пользователем и не требует вызова сервисного инженера. Существуют конфигурации с разным набором лазеров и детекторов, с загрузкой из одиночных пробирок (конфиг. SL) и/или из 96-луночных планшетов (конфиг. HT). В целом, это простой, надежный и недорогой прибор для решения разного типа задач.
Технические характеристики:
твердотельные полупроводниковые лазеры, до 3 лазеров из списка: 405, 488, 532 и 642 нм;
регистрация до 14 параметров: 2 детектора светорассеяния и до 12 каналов флуоресценции;
минимальный объем образца — 100 мкл для лунок планшета, 150 мкл для пробирок объемом 0,5 мл, 900 мкл для пробирок объемом 1,5 мл;
диапазон концентрации клеток, тыс. кл./мл — 10-500;
скорость: 7-70 мкл/мин, 10-1000 событий в секунду;
точность: коэффициент вариации менее 4% (определен по ядрам эритроцитов курицы);
Проточная цитометрия с функцией визуализации в потоке — это новое направление, сочетающее в себе не только возможности математического и статистического анализа клеток, но и микроскопию высокого разрешения каждой анализируемой клетки в потоке.
Системы ImageStreamX MKII и FlowSight обеспечивают анализ большого количества изображений каждой клетки в потоке, включая светлопольный и темнопольный каналы (SSC) и до 10 флуоресцентных каналов на высокой скорости.
Комбинирование скорости, чувствительности и фенотипических возможностей проточной цитометрии с одной стороны и детализации изображений и функциональных возможностей
микроскопии с другой стороны, позволяют визуализирующим проточным цитометрам ImageStream и FlowSight обойти ограничения обоих методов и открывают двери для широкого
спектра новых приложений.
Цитометры FlowSight и ImageStreamX функционируют как обычные проточные цитометры, но также обеспечивают анализ изображений каждой клетки. Мощное и интуитивно понятное программное обеспечение позволяет беспрепятственно связывать количественные данные
с изображениями:
нажмите на точку в любом плоте данных, чтобы увидеть соответствующее изображение;
кликните на интервал на любой гистограмме, чтобы увидеть каждую клетку в этом интервале;
нарисуйте гейты на дот-плотах и вы увидите результирующие популяции клеток для валидации результатов.
Иннновационная технология цитометров Amnis увеличивает сигнал и уменьшает шум, обеспечивая беспрецедентную фотонную чувствительность. Детали конфигурации, такие как специальный боковой скаттер-лазер, регулируемая интенсивность лазерного излучения и анализ светлопольных изображений для прямого анализа клеток позволяют системе более эффективно разделять клеточные популяции, чем при использовании более дорогих проточных цитометров. Простота в использовании, выдающаяся производительность и анализ изображений каждой клетки отвечают потребностям как новичков, так и экспертов в области проточной цитометрии.
Применим в любой научно-исследовательской дисциплине;
детекция с использованием высокочувствительной камеры Hamamatsu, что позволяет драматически улучшить разрешение по отношению к традиционным проточным цитометрам;
сконфигурирован для задач лабораторий любого фокуса и бюджета;
характеризует популяции практически по любому визуальному или флуоресцентному параметру;
лазеры — до 4-х:
стандартно — 488 нм;
опция — 405, 561, 642 нм;
до 12 каналов детекции;
опциональный автосэмплер для 96-луночных планшетов;
Уникальная особенность Attune NxT — функция акустической фокусировки, позволяющей проводить измерения с высокой скоростью без потери качества, сохраняя низкую вариабельность.
Возможности технологии акустической фокусировки:
высокая скорость анализа при минимальном расходе реагентов;
высокая точность и минимальная вариабельность данных;
быстрый анализ без потери чувствительности;
детекция редких событий в количестве, достаточном для статистической обработки;
окраска антителами без необходимости отмывки.
Технические характеристики:
лазеры — до 4х одновременно из 5 доступных: 405 нм (50 мВт), 488 нм (50 мВт), 532 (100 мВт), 561 нм (50 мВт), 637 нм (100 мВт);
профиль лазеров: 10 x 50 мкм, с плоской вершиной;
каналы детекции — FSC¹, SSC², до 14 флуоресцентных, опциональный дополнительный параметр SSC на фиолетовом лазере (405 нм);
чувствительность MESF³ — ≤ 80 MESF for FITC, ≤ 30 MESF for PE, ≤70 MESF for APC;
формат загрузки — пробирки размерами от 17 x 100 мм до 8,5 x 45 мм (включая стандартные пробирки на 1,5, 2 и 5 мл), опциональный автозагрузчик для 96- и 384-луночных планшетов;
скорость потока — 12,5-1000 мкл/мин;
скорость сбора данных — до 65 000 клеток/сек;
метод определения концентрации клеток — прямой подсчет;
габариты, Ш × Г × В — 400 × 580 × 430 мм;
вес — 29 кг.
¹ forward scatter, прямое светорассеивание;
² side scatter, боковое светорассеивание;
³ molecules of equivalent soluble fluorochrome, число молекул эквивалентного растворимого флуорохрома.
Лекция, 60 мин. Analysis of Surface Antigens on Exosomes using the Invitrogen Attune NxT Flow Cytometer
Лекция, 45 мин. The Use of Flow Cytometry to Identify Cancer Stem Cells in Primary Tumors and in Circulation
Примеры статей с использованием проточного цитофлуориметра Attune NxT
1) An Advanced Protocol for the Quantification of Marine Sediment Viruses via Flow Cytometry Mara Elena Heinrichs, Daniele De Corte, Bert Engelen and Donald Pan.
Разработка протоколов для подсчета вирусных частиц с помощью проточной цитометрии Attune NxT в морских донных отложениях.
doi.org/10.3390/v13010102.
2) Control of Multigene Expression Stoichiometry in Mammalian Cells Using Synthetic PromotersYash D. Patel,Adam J. Brown, Jie Zhu, Guglielmo Rosignoli, Suzanne J. Gibson, Diane Hatton, David C. James.
Использование Attune NxT для контроля стехиометрии мультигенной экспрессии, с использованием синтетических промоторов в клетках млекопитающих.
doi: 10.1021/acssynbio.0c00643.
3) Immunomodulatory Responses of Two Synthetic Peptides against Salmonella Typhimurium Infection. Marco Antonio Ibarra-Valencia, Gerardo Pável Espino-Solis, Blanca Elisa Estrada and Gerardo Corzo.
Иммуномодулирующий потенциал синтетических антимикробных пептидов оценивали путем определения профилей экспрессии цитокинов с помощью проточного цитометра Attune NxT.
doi: 10.3390/molecules26185573.
4) ATP13A3 is a major component of the enigmatic mammalian polyamine transport system. Norin Nabil Hamouda, Chris Van den Haute, Roeland Vanhoutte, Ragna Sannerud, Mujahid Azfar, Rupert Mayer, Álvaro Cortés Calabuig, Johannes V Swinnen, Patrizia Agostinis, Veerle Baekelandt, Wim Annaert, Francis Impens, Steven H L Verhelst, Jan Eggermont, Shaun Martin, Peter Vangheluwe. Attune NxT использовался для изучения новых компонентов системы транспорта полиаминов через мембрану у млекопитающих.
doi: 10.1074/jbc.RA120.013908.
5) Microengineered perfusable 3D-bioprinted glioblastoma model for in vivo mimicry of tumor microenvironment. Lena Neufeld¹, Eilam Yeini¹, Noa Reisman¹, Yael Shtilerman¹, Dikla Ben-Shushan¹, Sabina Pozzi¹, Asaf Madi², Galia Tiram¹, Anat Eldar-Boock¹, Shiran Ferber¹, Rachel Grossman³, Zvi Ram³, Ronit Satchi-Fainaro¹ ⁴ *.
В лабораторных исследованиях многие лекарственный препараты показывают многообещающие результаты, но в конечном итоге не проходят клинические испытания. Современные модели рака неадекватны и это основная проблема. У большинства моделей отсутствует взаимодействие опухоль – строма, для правильного представления комплексной биологии рака. Гетерогенное микроокружение фибриновой глиобластомы, состоящей из клеток глиобластомы, астроцитов и микроглии, воспроизвели материалом полученным от пациентов. 3D-модель может стать основой для быстрого, воспроизводимого и надежного обнаружения цели, персонализированный скрининг, разработка лекарств, и потенциально заменить клеточные культуры и модели животных, в качестве мощной платформы.
Проточний цитофлуоримета Attune NxT использовался для оценки экспрессии Р-селектина в клетках, выращенных в 2D-культуре (2D culture) и в фибрине – 3D-бионик (fibrin 3D-bioink). С помощью проточного цитофлуориметра Attune NxT показан высокие уровни экспрессии P-селектина на клетках PD-GB4, выращенных в фибрине – 3D-бионик по сравнению с 2D культурой.
doi: 10.1126/sciadv.abi9119.
Проточный цитометр Attune CytPix для широкого спектра задач – компактный, простой, удобный в использовании.
С помощью изображений полученных Attune CytPix можно оценит морфологию клеток, отслеживать контаминацию, показать межклеточные взаимодействия, морфологические характеристики апоптотических клеток и убедиться, что через луч лазера проходит отдельная клетка, а не конгломераты, их обломки или мусор, а так же можно просматривать и группировать изображения.
Уникальные особенности проточного цитометра Attune CytPix
Возможность протокола анализа без лизиса и отмывок для минимизации потери клеток, и экономии время, а также упрощение подготовки;
снижение времени пробоподготовки на 65%;
характеристика клеточных популяций;
стабильное качество изображения при высокой скорости потока;
описание морфологии апоптотических клеток;
исследование межклеточных взаимодействий;
контроль качества клеточных культур, отслеживание контаминации;
просмотр и группировка изображений, а также определение типов клеток;
визуализация для подтверждения и настройки гейта, включая только отдельные клетки, представляющие интерес;
система очистки, которая механически уменьшает возникновение засорения.
Протоколы подготовки образцов.
Примеры использования проточного цитометр Attune CytPix
Рисунок 1. Ядра эритроцитов курицы (CEN) склонны слипаться в дублеты или другие агрегаты. Стратегия гейтирования слипшихся ядер эритроцитов курицы с Attune CytPix.
Рисунок 2. С помощью проточного цитометра Attune CytPix можно просматривать и группировать изображения, а также определять типы клеток E. coli на основе их морфологических характеристик. В течении роста клетки E. coli, развиваются в два типа колониеобразующих клеток - короткие, которые напоминают отдельные клетки, и удлиненные структуры.
Рисунок 3. Отслеживание контаминации критически важно для анализа клеточных линий. На пример, перед трансплантацией клеток Вы можете их проверить на контаминацию с помощью Attune CytPix.
Рисунок 4. Визуализация Attune CytPix показывает межклеточные взаимодействия на примере CAR T-клеток, нацеленных на клетки лимфомы.
Рисунок 5. Анализ апоптоза клеток (с использованием аннексина V и PI) дополняется изображениями с выявленным морфологическим особенностями каждой клетки. Морфологические характеристики апоптотических клеточных популяции, полученные проточным цитометром Attune CytPix.
Особые преимущества проточного цитометра с визуализацией Attune CytPix
Программное обеспечение и камера проточного цитометраAttune CytPix гарантируют, что события, которые анализируются, являются отдельными клетками, а не дублетами, скоплениями, обломками клеток или мусором.
Акустическая фокусировка в 10 раз быстрее любой другой в проточном цитометреAttune CytPix.
Гидродинамическая фокусировка обеспечивает точное позиционирование клеток по центральной оси, позволяя клеткам быть сосредоточенными на точку лазерного луча и совместно с высокоскоростной камерой обеспечивает качественную картинку (Рисунок 6).
Проточный цитометр Attune CytPix с высокоскоростной камерой имеет большое значение для исследования в области клеточной биологии, генной терапии и оптимизации их протоколов.
Рисунок 6. Акустическая фокусировка в сравнении с традиционной гидродинамической фокусировкой.
Рисунок 7. Стабильное качество изображения при высокой скорости потока 12,5 мик/мин, 25 мик/мин, 100 мик/мин, 200 мик/мин, 500 мик/мин и 1000 мик/мин. Нет изменений в частоте визуализации и получению картин. Простая настройка фокуса и камеры для получения качественного изображения.
Технические характеристики проточного цитометра Attune CytPix
Количество лазеров – 2/4;
каналы детекции – канал прямого и бокового светорассеяния и 14 флуоресцентных каналов;
освещение изображения – 405 нм лазер с менее 50 наносекундный импульс;
акустическая фокусировка;
чувствительность – ≤80 MESF for FITC, ≤30 MESF for PE, ≤70 MESF for APC;
скорость анализа, событий/сек – более 35 тыс.;
скорость фотографии, фото/сек – 6000;
кратность увеличения – 20×;
разрешение камеры, нм/Мп – 0,3;
размер частиц, нм – до 800;
статус использования – только для исследований;
программное обеспечение – Invitrogen Attune 21 CFR Part 11;
процессор – Nvidia Quadro P2200 GPU;
жесткий диск – 2 x 8TB SSD, 2,5-inch Samsung 870 QVO, 560 MB/s;
габариты, В × Ш × Г, см – 49 × 58 × 43.
Опции: автоподатчик InvitrogenCytKick Autosampler и робот подачи планшетов Orbitor RS2 Microplate Mover увеличат операционную мощность, уменьшат количество ошибок, связанных с человеческим фактором.
Рисунок 8. Дополнительные конфигурации увеличивают операционную мощность, уменьшают количество ошибок, связанных с человеческим фактором.
(A) Attune CytPix Flow Cytometer
(B) Invitrogen CytKick Autosampler
(C) Orbitor RS2 Microplate Mover
Таблица 1. Сравнение автосэмплеров Invitrogen CytKick и CytKick Max
Характеристика
Автосэмплер CytKick
Автосэмплер CytKick Max
Пропускная способность
42 мин для 96-луночного планшета в высокопропускном режиме
22 мин для 96-луночного планшета (в ускоренном режиме с одной промывкой, одного смешивания и полного анализа образца 20 мкл)
Совместимость
96-луночные глубоколуночные планшеты
96-луночные стандартные планшеты
384-луночные глубоколуночные планшеты
384-луночные стандартные планшеты
96-луночные глубоколуночные планшеты
96-луночные стандартные планшеты
384-луночные глубоколуночные планшеты
384-луночные стандартные планшеты
1,5 и 2 мл микроцентрифужные пробирки в шативе (до 24 мест)
96-луночные планшеты, запечатанные фольгой
384-луночные планшеты, запечатанные фольгой, дополнительные типы планшет
Таблица 2. Конфигурации цитометра Attune CytPix.
Лазеры
Конфигурация лазеров
Число каналов детекции для выбранных лазеров
Всего каналов детекции*
Каталожный номер
Фиолетовый,
405 нм
Синий,
488 нм
Желтый,
561 нм
Красный,
637 нм
2
Синий / желтый
†
3
4
†
9
A51842
Синий / красный
†
4
†
3
9
A51840
Синий / фиолетовый
4
4
†
†
10
A51841
Синий / фиолетовый 6
6
4
†
†
11
A51843
3
Синий / красный / желтый
†
3
4
3
12
A51845
Синий / фиолетовый /желтый
4
3
4
†
13
A51846
Синий / красный / фиолетовый
4
4
†
3
13
A51844
Синий / красный / фиолетовый 6
6
3
†
3
14
A51847
4
Синий / красный / желтый / фиолетовый
4
3
4
3
16
A51848
Синий / красный / желтый / фиолетовый 6
6
2
3
3
16
A51849
* - Число каналов детекции включает все каналы флюоресценции, а также каналы прямого и бокового рассеяния.
† - Доступна модификация лазеров, зеленый лазер не доступен в Attune CytPix.
Таблица 3. Конфигурация лазеров, количество каналов детекции в сравнении Attune CytPix с Attune NxT
Лазеры
Конфигурация лазеров
Фиолетовый,
405 нм
Синий,
488 нм
Желтый,
561 нм
Зеленый,
532 нм
Красный,
637 нм
Всего каналов детекции*
Attune CytPix
Attune NxT
1
Синий
**
4
**
**
**
6
N/A
A24864
2
Синий / зеленый
**
3
4
**
9
N/A
A28995
Синий / желтый
**
3
4
**
9
A51842
A24861
Синий / красный
**
4
**
**
3
9
A51840
A24863
Синий / фиолетовый
4
4
**
**
**
10
A51841
A24862
Синий / фиолетовый 6
6
3
**
**
11
A51843
A29002
3
Синий / зеленый / красный
**
3
4
3
12
N/A
A28997
Синий / красный / желтый
**
3
4
3
12
A51845
A28993
Синий / зеленый / фиолетовый
4
3
4
**
13
N/A
A28999
Синий / фиолетовый / желтый
4
3
4
**
13
A51846
A24859
Синий / красный / фиолетовый
4
4
**
**
3
13
A51844
A24860
Синий / красный / фиолетовый 6
6
3
**
3
14
A51848
A29003
4
Синий / красный / фиолетовый / зеленый
4
3
4
3
16
N/A
A29001
Синий / красный / желтый / фиолетовый
4
3
4
3
16
A51848
A24858
Синий / красный / желтый / фиолетовый 6
6
2
3
3
16
A51849
A29004
* - Число каналов детекции включает все каналы флюоресценции, а также каналы прямого и бокового рассеяния.
** - Доступна модификация лазеров, зеленый лазер не доступен в Attune CytPix.
Выбрать можно конфигурацию прибора, соответствующую вашим потребности. Проточный цитометр Attune CytPix доступен в конфигурациях с 2–4 лазерами с визуализацией в светлом поле, а проточный цитометр Attun NxT доступен с 1–4 лазерами без визуализации.
Таблица 4. Выбор красителей для определения жизнеспособности клеток
Проточный цитофлуориметр ZE5 — надежный, гибкий, высокопроизводительный анализатор для лабораторий с большим потоком образцов.
Уникальные особенности проточного цитофлуориметра ZE5, Bio-Rad
Цитофлуориметр ZE5 имеет до пяти лазеров и 30 детекторов, позволяет работать с любой вашей панелью; переключается между пробирками, штативами или планшетами без изменения конфигурации программного обеспечения; проводит автоматическую проверку всех фильтров на предмет их наличия и правильного расположения.
Цитофлуориметр ZE5 обеспечивает высокопроизводительный скрининг отдельных клеток, эффективный скрининг процессов передачи белков, мониторинг пациентов, проходящих иммунотерапию. Кроме исследований иммуногенности, разработки вакцины, открытия фенотипических лекарств, скрининга терапевтических антител, открытие биомаркеров рака, также может проводить работу по исследованию наночастиц.
В ситуации пандемии коронавируса облегчает скрининг сывороточных антител, реактивных к антигенам SARS-CoV-2.
Возможности цитофлуориметра ZE5:
большое количество анализируемых параметров (до 30) обеспечивают гибкость в работе;
высокая скорость анализа (до 100 000 событий в секунду, < 8 мин на 96-луночный планшет) обеспечивает высокую производительность;
конструкция оптической системы (одинаковое расстояние от проточной ячейки до каждого детектора), фотоумножители Hamamatsu H11903 обеспечивают высокую чувствительность и разрешение;
увеличенная стабильность лазерного пучка, верифицирование оптической системы ZE5 EYE обеспечивают стабильность и надежность результатов;
возможность прямого подключения внешнего источника деионизированной воды и слива, замена емкостей с сервисными растворами без остановки измерения, автоматические процедуры старта и выключения обеспечивают удобство в обслуживании;
универсальный автоматический автозагрузчик для любого типа пробирок или планшетов, контроль температуры, переноса пробы, предотвращение повреждения пробозаборника;
возврат неиспользованного образца;
конструкция проточной ячейки, высокочувствительная электроника обеспечивают низкие CV даже при высокой скорости потока.
Компактный, легкий в использовании проточный цитометр CytoFLEX для широкого спектра научных исследований.
Уникальная конструкция цитометра и конфигурации от 1 до 6 лазеров и от 4 до 21 флуоресцентных параметров обеспечивают поддержку большинства мультипараметрических приложений.
Компактные размеры, простое обслуживание, исключительные чувствительность, разрешение и надежность отличают CytoFLEX во всех его конфигурациях. Все это вместе со стабильной производительностью обеспечивает конкурентные преимущества CytoFLEX.
Запатентованный детекторный модуль на базе технологии спектрального мультиплексирования состоит из твердотельных, высокоэффективных фотодиодных детекторов с низким уровнем шума, что обеспечивает экстраординарное разрешение для получения более точных данных и лучшей регистрации редких событий.
Бренд CytoFLEX включает три серии приборов: CytoFLEX, CytoFLEX S и CytoFLEX LX, различающиеся по максимальному числу лазеров и количеству флуоресцентных параметров, позволяя подобрать прибор под любую исследовательскую задачу.
Технические характеристики цитометров CytoFLEX
Все цитометры CytoFLEX имеют следующие технические характеристики:
фиксированная встроенная оптика и кварцевая проточная ячейка
Проточная цитометрия с функцией визуализации в потоке — это новое направление, сочетающее в себе не только возможности математического и статистического анализа клеток, но и микроскопию высокого разрешения каждой анализируемой клетки в потоке.
Системы ImageStreamX MKII и FlowSight обеспечивают анализ большого количества изображений каждой клетки в потоке, включая светлопольный и темнопольный каналы (SSC) и до 10 флуоресцентных каналов на высокой скорости.
Комбинирование скорости, чувствительности и фенотипических возможностей проточной цитометрии с одной стороны и детализации изображений и функциональных возможностей
микроскопии с другой стороны, позволяют визуализирующим проточным цитометрам ImageStream и FlowSight обойти ограничения обоих методов и открывают двери для широкого
спектра новых приложений.
Цитометры FlowSight и ImageStreamX функционируют как обычные проточные цитометры, но также обеспечивают анализ изображений каждой клетки. Мощное и интуитивно понятное программное обеспечение позволяет беспрепятственно связывать количественные данные
с изображениями:
нажмите на точку в любом плоте данных, чтобы увидеть соответствующее изображение;
кликните на интервал на любой гистограмме, чтобы увидеть каждую клетку в этом интервале;
нарисуйте гейты на дот-плотах и вы увидите результирующие популяции клеток для валидации результатов.
Иннновационная технология цитометров Amnis увеличивает сигнал и уменьшает шум обеспечивая беспрецедентную фотонную чувствительность. Детали конфигурации, такие как специальный боковой скаттер-лазер, регулируемая интенсивность лазерного излучения и анализ светлопольных изображений для прямого анализа клеток позволяют системе более эффективно разделять клеточные популяции, чем при использовании более дорогих проточных цитометров. Простота в использовании, выдающаяся производительность и анализ изображений каждой клетки отвечают потребностям как новичков, так и экспертов в области проточной цитометрии.
Анализирует тысячи клеток в секунду при 60X увеличении;
простой пользовательский интерфейс с графиками и гейтированием в режиме реального времени;
система может быть сконфигурирована с любым числом лазеров — от одного до семи;
изменение увеличения микроскопа позволяет осуществлять анализ изображений как мелких частиц, так и очень больших клеток или даже их конгломератов.
Технические характеристики:
лазеры – до 7:
стандартно 488 нм;
опция 375, 405, 561, 592, 642, 730 нм;
стандартно 6 каналов флуоресценции высокого разрешения (до 12 каналов опционально);
увеличение 40Х (стандарт) и 20Х, 60Х (опция);
опциональный автосэмплер для 96-луночных планшетов.
Проточный цитометр CellStream, Luminex — компактная система, обладающая высокой чувствительностью и гибкостью для мультипараметрического анализа клеток и субмикронных частиц:
до 7 неколлинеарных лазеров,
до 20 флуоресцентных каналов,
возможность визуальной верификации результатов.
Уникальная система детекции сигнала Amnis, используемая в цитометрах CellStream, обеспечивает высокую чувствительность, до 10 раз превышающую чувствительность фотоумножителей (PMT, photomultiplier tube) традиционных систем проточной цитометрии. CCD камера с большой скоростью захватывает усиленные с помощью технологии TDI (time delay integration, накопление сигнала во времени) изображения низкого разрешения и трансформирует их в высокоинформативные данные по интенсивности. В результате исследователь получает данные по интенсивности, привычные для традиционной проточной цитометрии, но с большей чувствительностью флуоресценции.
В отличие от традиционных систем на базе PMT, проточный цитометр CellStream регистрирует изображения, что дает возможность анализировать морфологические параметры и обеспечивает визуализацию всех событий, а следовательно, и простую верификацию выделения популяций, отделения одиночных событий от агрегатов и т.д.
Уникальные возможности CellStream:
запатентованная камера с уникальной технологией TDI для проточных цитометров Amnis;
визуальное подтверждение результатов;
высокие чувствительность и разрешение;
анализ морфологических параметров: площадь, соотношение сторон, значение интенсивности самого яркого пикселя — наряду с данными по общей интенсивности;
детекция и разделение субмикронных частиц;
автоматические очистка и калибровка;
автосэмплер для 96-луночного планшета уже в базовой комплектации;
Сортер клеток S3e от Bio-Rad — это инновационная система сортинга с классической системой гидродинамической фокусировки, предназначенная для решения научно-прикладных задач в области сортировки клеток, в зависимости от сигнала флуоресцентной метки. В приборе реализована инновационная технология ProDrop.
В проточном цитометре, оборудованном системой для сортировки клеток, проточная ячейка закреплена на пьезокристалле. При подаче на него напряжения кристалл вместе с ячейкой совершает колебания с заданной частотой, в результате чего струя жидкости с клетками разбивается на отдельные капли. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержится внутри капли. Пролетая мимо отклоняющих пластин, капля с клеткой притягивается к ним, выходит из основного потока и попадает в пробирку. Суть технологии ProDrop заключается в том, что после прохождения процедуры детекции и сортинга калибровочных частиц ProLine, несортированные частицы подвергаются вторичной детекции на выходе, что позволяет оценить, насколько успешно прошла процедура сортировки, и в автоматическом режиме внести коррекцию процедуры без вмешательства пользователя.
Технические характеристики сортера клеток S3e
Уровень чувствительности, событий/сек — до 100000;
частота сортировки, событий/сек — до 30000;
точность сортировки, % — более 99;
диаметр сопла, мкм — 100;
направление сортировки — 2-х линейное;
источник света — до 3 лазеров на выбор из 4 доступных (405, 488, 561, 640 нм);
детекция в 4-х флуоресцентных каналах (525/30, 586/25, 615/25, 655 нм);
чувствительность менее <125 MESF для красителей FITC и PE;
сортировка до 5 пробирок по 5 мл каждого направления селекции,
возможность сортировки в стрипованные пробирки и на предметные стекла
для микроскопии;
минимальное разрешение — 0,5 мкм;
система охлаждения Пельтье, температурный диапазон, °C — от 4 до 37;
габариты, ШхГхВ, см — 70×65×65.
Комплект поставки: сортер клеток S3e, лазерs 488 и 561 нм, 4 флуоресцентных детектора, калибровочный набор, контейнеры (2 шт.) для реагентов и отходов, соединительные трубки, ПО ProSort, кабель, ПК.
Примеры использования сортера клеток S3e, Bio-Rad
Видео 5 минут: Investigating Cancer Stem Cells with the S3e Cell Sorter
Лекция 50 минут: Advanced Topics in Cell Sorting
Видео 5 минут: Identifying Predictive Biomarkers for Successful Immunotherapy Treatments.
Find out how the S3e Cell Sorter can help scientists discover new biomarkers that have the potential to become new therapies for cancer and other diseases.
Статьи с использованием сортера клеток S3e, Bio-Rad
1. Exosome mediated miR-155 delivery confers cisplatin chemoresistance in oral cancer cells via epithelial-mesenchymal transition Prathibha Kirave, Piyush Gondaliya1, Bhagyashri Kulkarni1, Rakesh Rawal, Rachana Garg, Alok Jain and Kiran Kalia
Естественный груз для миРНК это эксосомы, которые облегчают межклеточную коммуникацию в микросреде опухоли. Нарушение регуляции miRNA обычное явление при раке, и играет важную роль в устойчивости к химиотерапии. Опосредованный экзосомами перенос miRNA может играть важную роль устойчивости к лекарственным препаратам и служить мишенью для терапии рака. В изучению эксосомов, miRNA, сортер клеток S3e, Bio-Rad имеет критическую роль в данном случае для определения клеточного цикла.
doi: 10.18632/oncotarget.27531
2. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Jérémy Surre
Прокариотические и эукариотические клетки обладают собственной естественной флуоресценцией из-за присутствия флуоресцентных клеточных структурных компонентов и метаболитов. Клеточная аутофлуоресценция (AF) зависит от метаболического состояния клеток. В данной статье было изучено воздействие различных стрессоров на изменение аутофлуоресценции клеток Escherichia coli. Спектры возбуждения и испускания, а также повышенная экспрессия генов биосинтеза флавинов убедительно свидетельствуют о том, что флавины вносят основной вклад увеличению аутофлуоресценции.
Повышенная экспрессия генов, кодирующих различные флавопротеины, указывает на клеточную стратегию борьбы с тяжелыми стрессами. Наблюдаемое усиление аутофлуоресценции при стрессе – это эволюционно законсервированное явление, поскольку оно происходит не только в клетках разных видов бактерий, но также в клетках дрожжей и человека. Влияние ампициллина на прямое рассеяние света и интенсивность автофлуоресценции клеток E. coli, а так же клеточное выживание, определялось сортером клеток S3e, Bio-Rad.
doi: 10.1038/s41598-018-30623-2
3. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes Siebe Loontiens, Lisa Depestel, Suzanne Vanhauwaert, Givani Dewyn, Charlotte Gistelinck, Karen Verboom, Wouter Van Loocke, Filip Matthijssens, Andy Willaert, Jo Vandesompele, Frank Speleman & Kaat Durinck
Контроль транскрипции зависит от активности комплексов факторов транскрипции, метилирования ДНК, динамики модификации хроматина, а также образования петель ДНК более высокого порядка. На перестройку транскрипционных сетей во время развития рака большое влияние оказывают генетические поражения и эпигенетические изменения. Секвенирование РНК в настоящее время служит золотым стандартом для подробной и объективной молекулярной характеристики модельных систем как in vitro, так и in vivo.
В последние годы zebrafish (Danio rerio) становится все более важной в качестве модельного организма. Эмбриональное развитие у рыбок данио происходит быстро. Разработка линий флуоресцентных репортеров рыбок Danio rerio, в которых флуоресцентный маркер управляется промотором (специфичным для определенного типа клеток), делает возможным выполнение сортировки флуоресценцией клеток – сортер клеток S3e, Bio-Rad. Таким образом можно определять клеточное - специфические транскриптом, которые могли бы быть замаскированы при анализе РНК, полученной из целого эмбриона. Сортировка большого количества клеток (> 1 миллиона) не всегда возможна при работе с флуоресцентными репортерными эмбрионами. В зависимости от выбранного промотора флуоресцентный маркер может экспрессироваться только в небольшом количестве клеток и, таким образом, приводит к низкому выходу РНК. Учитывая важность получения достаточного количества высококачественной РНК для исследований экспрессии, было оптимизировано извлечение РНК из отсортированных с помощью – сортер клеток S3e, Bio-Rad – клеток эмбрионов рыбок данио и провелена углублення оценка качества извлеченной РНК.
doi: 10.1186/s12864-019-5608-2
Настольный клеточный сортер на базе CytoFLEX S от компании Beckman Coulter – CytoFLEX SRT – вобрал все лучшее от клеточных анализаторов CytoFLEX (лавинные фотодиодные детекторы (APD), высокую чувствительность и удобство использования), добавив возможность сортировки до 4 клеточных популяций.
Технические характеристики:
фиксированная встроенная оптика и кварцевая проточная ячейка;
Проточные цитофлуориметры (цитометры) — высокопроизводительные системы анализа частиц (как правило, клеток) в потоке жидкости. Анализ частиц ведется с большой скоростью (до десятков тысяч в секунду), причем каждая частица анализируется отдельно. Метод проточной цитометрии позволяет получать за короткое время качественные и количественные данные по анализируемым частицам с высокой статистической достоверностью.
Проточные цитометры используются для широкого круга задач, связанных с анализом клеток, таких как подсчет клеток, иммунофенотипирование (в иммунологии, гематологии, онкологии, при культивировании клеток и пр.), клеточный цикл и пролиферация, клеточное здоровье и апоптоз, автофагия, клеточный сигналинг, токсикология, эффективность трансфекции и т.д. Типичные объекты — клетки человека и животных, клетки растений и микроводоросли, дрожжи, бактерии, микрочастицы и экзосомы.
Центральным элементом проточного цитометра является проточная ячейка, в которой клетки выстраиваются друг за другом в ламинарном потоке жидкости и проходят через луч лазера. Лазерный луч, проходя через клетку, отклоняется, рассеивается и вызывает флуоресценцию красителей, которыми маркируются исследуемые структуры.
Отклоненный и рассеянный свет облучающего лазера, а также свет, полученный в результате флуоресценции, попадает на детекторы, переводится в цифровой сигнал, значение которого пропорционально интенсивности попавшего на детекторы света. Данные по интенсивности обрабатываются компьютером и выводятся в виде графиков и статистических характеристик.
Существует несколько типов проточных ячеек. Большинство проточных цитометров использует проточную ячейку с гидродинамической фокусировкой: ламинарный поток создается потоком обжимающей жидкости (sheath fluid), которая со всех сторон «обжимает» образец. Другой тип проточных ячеек использует капиллярные взаимодействия для создания ламинарного потока: образец подается в микрокапилляр или в чип, работающий по принципу микрофлюидики.
Скорость, с которой клетки движутся в потоке, определяет время измерения: чем выше скорость, тем быстрее проходит измерение, но выше вариабельность результатов (часто выражается в виде коэффициента вариации, CV, coefficient of variation). Высокие значения CV могут затруднить разделение популяций клеток, усложнить трактовку результатов измерения. Для уменьшения CV при больших скоростях может применяться акустическая фокусировка клеток в потоке.
В качестве источника света в проточных цитометрах используются лазеры. Наиболее универсальный — голубой (длина волны 488 нм), широко распространены также красный (642 нм) и фиолетовый (405 нм) лазеры. Для решения специальных задач могут дополнительно устанавливаться лазеры с другими волнами излучения. От «цвета» лазера зависит выбор флуорохромов, которые можно использовать для окраски. Увеличение количества лазеров существенно расширяет этот выбор, позволяет подбирать более эффективные комбинации флуорохромов для характеристики клеток, увеличивать количество параметров клеток, которые можно проанализировать за одно измерение.
В системах с несколькими лазерами свет, полученный при облучении клетки, может собираться для всех лазеров одновременно (коллинеарные системы) или для каждого лазера отдельно (например, при пространственном разделении точек облучения клеток каждым лазером). В последнем случае можно в рамках одного измерения использовать флуорохромы, имеющие сходный спектр эмиссии, если они различаются по спектру возбуждения.
В качестве детекторов светового сигнала от клеток в традиционных проточных цитометрах используются PMT (photomultiplier tube, фотоумножители), которые представляют собой вакуумную лампу с двумя основными электродами (катод и анод) и несколькими промежуточными (диноды). Свет, полученный при облучении клеток, падает на фотоэлектрод PMT и выбивает из него электроны. Эти электроны летят к диноду и каждый из них выбивает еще несколько, которые летят к следующему диноду и т.д. Таким образом, PMT не только преобразует световой сигнал в электрический, но и значительно его усиливает. Благодаря своей чувствительности, PMT до сих остается самым распространенным детектором для проточных цитометров.
Другой вариант детекторов — фотодиоды — все больше набирает популярность с развитием технологии их производства, повышением их чувствительности.
Таким образом, фотоны света преобразуются в электрический импульс, величина которого пропорциональна попавшему на детектор свету. То есть, например, чем больше в клетке окрашенных структур, тем ярче она флуоресцирует, тем сильнее электрический сигнал, регистрируемый на детекторе. Детектор регистрирует весь свет, который на него попадает, поэтому для многоцветного анализа весь спектр, который приходит от клеток необходимо делить на узкие спектральные полоски при помощи серии фильтров, и каждый участок спектра попадает на отдельный детектор, соответствующий определенному «цвету».
В системах, использующих PMT или фотодиоды, анализируется общая интенсивность светового сигнала с каждой клетки, саму клетку, ее форму при этом увидеть невозможно. О том, что точка на графике — это именно исследуемая клетка, приходится догадываться с той или иной степенью вероятности (вместо термина «клетка» принято говорить «событие»). Проблема верификации выделенных популяций «событий» стоит остро и решается дополнительными процедурами анализа, контролями, привлечением клеточного сортинга с последующей микроскопией. Удачным сочетанием наглядности микроскопии и скорости проточной цитометрии стали визуализирующие проточные цитометры (Imaging Flow Cytometers). В качестве детектора в них используется CCD-камера. Хотя чувствительность CCD-матрицы ниже, чем PMT, ее можно значительно усилить. Так, технология TDI (time delay integration, накопление сигнала во времени) предусматривает электронное сопровождение движущихся объектов (клеток). Скорость «перемещения» засвеченных пикселей по матрице синхронизируется со скоростью клетки в потоке, собранные данные по интенсивности изображения на каждом участке матрицы накапливаются и собираются в одно изображение с повышенной яркостью и четкостью. В результате, такие системы обладают чувствительностью, не уступающей и даже превышающей чувствительность PMT. Визуализация любого события обеспечивает верификацию без дополнительных ухищрений и позволяет исследовать популяции, которые в традиционной цитометрии отбрасываются. Каждой точке на графике в визуализирующей проточной цитометрии соответствует изображение, на котором можно проследить не только наличие или отсутствие определенной структуры, но и подсчитать количество этих структур, локализацию в клетке, качественно и количественно оценить морфологию клеток.
По возможности отделить нужную популяцию от остальных клеток проточные цитометры делят на анализаторы (только логическое выделение) и сортеры (логическое и физическое выделение нужных клеток). Клеточные сортеры способны провести анализ, выбрать нужную популяцию и выделить ее в отдельную пробирку, лунку планшета или перенести на предметное стекло. Сортировка клеток – это получение одиночных клеточных популяции на основе их физических или биологических свойств, таких как размер, морфологические параметры, оценки жизнеспособность, внеклеточной и внутриклеточной экспрессией белка. Получение популяции клеток можно использовать в последующих экспериментах. Сортировка клеток также известна под аббревиатурой FACS (fluorescence-activated cell sorting) – сортировка клеток с активированной флуоресценции. Для разделения клеток большинство сортеров использует электростатическую сепарацию. После прохождения через луч лазера (т.е. после анализа) клетка изолируется в капле жидкости. В зависимости от результатов анализа капля с клеткой получает определенный электрический заряд, благодаря которому она отклоняется в электромагнитном поле и, в итоге, оказывается в пробирке с такими же клетками. Капли, не получившие заряд, попадают в слив и удаляются. В некоторых сортерах сортировка производится при помощи чипов на основе микрофлюидики.
Существуют также другие методы сортировки клеток: при помощи магнитной сепарации (MACS, magnetic-activated cell sorting), при помощи микропузырьков (BACS, buoyancy activated cell sorting), сортировка единичных клеток при помощи микрочипов.
Проточные цитометры придуманы и используются для анализа дискретных частиц: клеток животных и человека, растительных клеток, водорослей, грибов, микроорганизмов. Исследуемые структуры или вещества должны быть расположены на поверхности или внутри этих частиц. Однако существуют также приложения для исследования растворенных веществ — то, чем традиционно занимается ИФА. Для детекции на проточном цитометре растворенных аналитов их нужно связать с частицами, которые сможет «увидеть» проточный цитометр. В качестве таких частиц используют бидсы (beads) — полимерные микросферы, сопоставимые по размеру с клетками (5-15 мкм), с которыми прочно связывают (иммобилизируют) антитела к исследуемому аналиту. В растворе молекулы аналита связываются с нанесенными на бидсы антителами, далее аналит дополнительно метят флуоресцентным красителем (также при помощи антител). По яркости флуоресценции этого красителя судят о концентрации аналита в растворе. Развитие этого метода привело к созданию мультиплексных анализаторов.
По спектру решаемых задач можно разделить проточные цитометры на открытые и закрытые. В открытых системах (большинство проточных цитометров) задачи и способ их решения определяются пользователем и ограничены только возможностями прибора и фантазией исследователя. Закрытые системы ориентированы на решение специализированных задач (одной или нескольких), методы анализа и, зачастую, реагенты определяются производителем этих приборов. Преимущества таких приборов – простота в использовании, минимальная необходимость оптимизации метода, зачастую меньшая цена, чем у открытых систем.
При выборе проточного цитометра стоит обращать внимание на следующие факторы:
какие наиболее типичные измерения, какие цветовые комбинации будут использоваться, какие характеристики прибора должны быть для проведения измерений: количество лазеров, количество флуоресцентных параметров;
тип детекторов флуоресценции (возможность визуализации);
разрешающая способность — способность различать тускло окрашенные популяции;
скорость анализа (актуальна при анализе редких популяций), складывается из возможного количества событий в секунду и скорости потока;
точность измерения, коэффициент вариации (CV) — особенно актуально при анализе клеточного цикла;
минимальный размер анализируемых частиц (актуально для изучения микроорганизмов и микровезикул);
наличие автосэмплера для автоматического анализа из нескольких пробирок или лунок планшета существенно освобождает время исследователя.
Специалист Диаэм по проточной цитометрии и мультиплексному анализу всегда поможет вам с подбором оптимальной модели.
Частично задачи можно решать на других приборах:
подсчет клеток и анализ из жизнеспособности — счетчики клеток;
Для повышения удобства работы с сайтом на нем используются файлы cookie.
В cookie содержатся данные о Ваших прошлых посещениях сайта. Если Вы не хотите, чтобы эти данные
обрабатывались, отключите cookie в настройках браузера.
Проточные цитофлуориметры (цитометры) — высокопроизводительные системы анализа частиц (как правило, клеток) в потоке жидкости. Анализ частиц ведется с большой скоростью (до десятков тысяч в секунду), причем каждая частица анализируется отдельно. Метод проточной цитометрии позволяет получать за короткое время качественные и количественные данные по анализируемым частицам с высокой статистической достоверностью. Проточные цитометры используются для широкого круга задач, связанных с анализом клеток, таких как подсчет клеток, иммунофенотипирование (в иммунологии, гематологии, онкологии, при культивировании клеток и пр.), клеточный цикл и пролиферация, клеточное здоровье и апоптоз, автофагия, клеточный сигналинг, токсикология, эффективность трансфекции и т.д. Типичные объекты — клетки человека и животных, клетки растений и микроводоросли, дрожжи, бактерии, микрочастицы и экзосомы. 
