Люминометры

Люминометры — приборы для количественного определения веществ по интенсивности флуоресценции. Флуоресценция является частным случаем люминесценции — явления испускания света химическим веществом, находящимся в возбужденном состоянии, при переходе в основное состояние. Испускание света после его поглощения происходит через определенный промежуток времени, этот временной промежуток — длительность пребывания молекулы в возбужденном состоянии. В зависимости от времени жизни различают люминесценцию с быстро затухающим излучением — флуоресценция, 10⁻⁹-10⁻⁶ c, и медленно затухающим излучением — фосфоресценция, 10⁻³-10 c. Также люминесценция различается по методу возбуждения:

• фотолюминесценция (облучение ультрафиолетовым и видимым светом);
• хемилюминесценция (в результате химических реакций);
• электролюминесценция (при воздействии электрическим током);
• биолюминесценция (обусловлена специфическими ферментами) и др.

Способностью флуоресцировать обладают молекулы многих биологических веществ: нуклеиновых кислот, коферментов, витаминов, продуктов окисления, пигментов и т.д. Флуоресценция органических соединений лежит в ультрафиолетовой (200-400 нм), видимой (400-760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра.

Флуориметрический метод (флуоресцентная спектрофотометрия) основан на возбуждении электронных спектров испускания молекул определяемого вещества при внешнем УФ-облучении при фиксированной длине волны возбуждающего облучения и измерении интенсивности излучаемого флуоресцентного света. Из-за частичной потери энергии при переходе молекулы из возбуждённого состояния в основное (стоксовы потери) длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света на 20-30 нм и более. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству света, адсорбированного образцом. Таким образом, она прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества и абсолютному значению начальной интенсивности света. При количественных определениях с использованием метода флуориметрии применяют калибровочные графики, построенные на основании флуориметрии эталонных растворов.

Флуориметрический анализ в относительно широкой области спектра проводят с помощью фильтрационных флуориметров, которые в канале возбуждения и флуоресценции имеют простой светофильтр. Свет от источника попадает на первичный фильтр (фильтр возбуждения), где происходит отбор длин волн требуемого интервала и блокирование остальных длин волн. Затем выделенное излучение попадает на кювету с пробой и возбуждает в ней флуоресцентное излучение, которое проходит через вторичный фильтр (фильтр эмиссии), отсекающий рассеянный возбуждающий свет, а затем попадает на фотодетектор, где пропорционально преобразуется в электрический сигнал.

Существенным является выбор светофильтров: светофильтр для возбуждения флуоресценции должен пропускать свет только в области поглощения исследуемого вещества и не должен пропускать свет в области, в которой образец флуоресцирует. Фильтр эмиссии должен пропускать флуоресценцию, но возбуждающий свет должен полностью им поглощаться. Подбирая такую пару светофильтров, следует добиваться их хорошей скрещенности: эти два светофильтра, сложенные вместе, совсем не должны пропускать свет.

Объекты анализа во флуориметрическом методе:

• нуклеиновые кислоты;
• белки;
• антитела, меченые флуоресцеином;
• алкалоиды;
• стероидные гормоны;
• витамины (рибофлавин, тиамин, никотинамид, аскорбиновая кислота и т.д.);
• ионы металлов;
• лекарственные препараты (хинин, морфин, индометацин и др.);
• токсичные вещества;
• высокомолекулярные соединения.

Области применения флуориметров:

• фармацевтическая промышленность (контроль качества препаратов, компонентный анализ проб);
• медицина (иммунологические исследования, диагностика заболеваний, изучение патогенеза);
• криминалистика (определение следов токсичных веществ, подлинности документов и т.п.);
• пищевая промышленность (количественное определение добавок, контроль качества упаковки);
• санитарно-эпидемиологический контроль (контроль качества пищевых продуктов, воды, содержание вредных веществ в воздухе);
• экологические исследования (оценка загрязнений почв и рек);
• водоснабжение и энергетика;
• химическая промышленность.

Преимущества флуориметрического метода:

• высокая чувствительность: определение концентраций до 10⁻⁹-10⁻⁸ моль/л (в 10-100 раз выше, чем у фотометрических методов);
• небольшой объем анализируемой пробы;
• специфичность: характер спектра флуоресценции, а также цвет излучаемого света специфичны для флуоресцирующих веществ, поэтому флуоресценция может быть применена для их идентификации;
• широкая область применения: с помощью химических превращений можно придать флуоресцентные свойства веществам, не являющимся флуорофорами
• сохранение образца (недеструктивность);
• по сравнению со спектрофотометрией: простое устройство прибора, возможность варьирования чувствительности в широком диапазоне за счет усиления тока фотоумножителя, результат определяется по калибровочной кривой (не требуется кювета сравнения).

Недостатки флуориметрического метода:

• многие флуорофоры не флуоресцируют в воде;
• изменение pH раствора может влиять на интенсивность свечения;
• высокая концентрация кислорода в растворе подавляет флуоресценцию;
• присутствие посторонних частиц может искажать сигнал (поглощение доли возбуждающей энергии, многократное отражение и т.д.);
• многие флуорофоры подвержены фоторазложению.

Люминометры используются для регистрации интенсивности излучения, возникающего в результате реакций био- и хемилюминесценции, которые катализируются, например, перкосидазой хрена, люциферазами светляков и бактерий. Характерная особенность люминометров — отсутствие источника света, поскольку свечение образца индуцируется химической реакцией или другим способом.

Одно из основных применений люминометра — определение уровня аденозинтрифосфата (АТФ), универсальной энергетической молекулы, находящейся во всех растительных, животных и бактериальных клетках, в том числе дрожжах и плесени. В результате биохимической реакции фермента люциферин/люцифераза с молекулами АТФ генерируется холодный свет, интенсивность которого регистрирует люминометр. Уровень АТФ измеряется в относительных световых единицах — RLU. Одной единице RLU соответствует 10⁻¹⁵ моль АТФ. Концентрация АТФ на поверхностях свидетельствует о наличиии микробной обсемененности, таким образом, люминометрия — быстрый и простой способ токсико-гигиенического мониторинга объектов.

Другие области применения люминометров:

• иммуноферментный анализ;
• анализ репортерных генов;
• анализ АТФ;
• анализ апоптоза;
• анализ токсичности и мутагенности.

В данном разделе представлены лабораторные флуориметры/люминометры для проведения измерений в диапазоне от 270 до 670 нм на планшетах от 6 до 384 лунок, в пробирках, виалах, чашках Петри. Специальная конструкция приборов позволяет устанавливать до 8 интерференционных фильтров и работать в широком диапазоне спектра. Приборы могут быть оснащены встроенным шейкером и инкубатором, принтером, а также автоматическими дозаторами (до 3 шт.). Для проведения точных спектральных измерений (регистрации спектров люминесценции или спектров возбуждения люминесценции) применяются спектрофлуориметры. Микробиологическую загрязненность можно контролировать с помощью люминометров АТФ, микробиологических экспресс-тестов.