Проточная цитометрия с Thermo Fisher Scientific

• Flow Cytometry Panel Builder
• Настройка второго лазера

Flow Cytometry Panel Builder

Для организации работы с проточными цитометрами ThermoFS предлагает программное обеспечение Flow Cytometry Panel Builder.

Этот инструмент можно использовать на разных типах компьютеров, в том числе на мобильных устройствах, для которых он хорошо адаптирован. А если пользователь зарегистрирован на сайте ThermoFS, он может не только создавать там собственные панели для цитометрических исследований, но и сохранять свои дизайны на сайте.

Вот как «собираются» в приложении такие панели.

Процесс начинается с выбора проточного цитометра.

Если в лаборатории пользователя используется проточный цитометр другого производителя, его также можно использовать, и указать на этом шаге, выбрав из всего списка приборов, присутствующих на рынке в настоящее время

Поскольку ThermoFS – возможно, крупнейший производитель различных антител для проточной цитометрии, исследователь может подобрать такие антитела и для использования со своим проточным цитометром другой марки.

В этом примере мы выберем проточный цитометр достаточно простой конфигурации – Attune NxT с двумя лазерами.

Приложение сообщит, какие в этом случае используются лазеры и каналы согласно спецификации самого инструмента. Если у пользователя какие-то флюоресцентные каналы были заменены, свойства выбранного проточного цитометра можно отредактировать: поставить в программе для него другой канал, указать другой светофильтр, если необходимо, добавить другой лазер, другие каналы. Возможно, кто-то работает с совершенно новыми флюоресцентными метками, которые раньше не были исследованы, для них можно закупать другие фильтры, подбирать их. Так редактируются свойства проточного цитометра.

Далее следует выбрать вид живого организма, для которого нужно создать панель.

Выбрать можно из огромного количества видов, воспользовавшись выпадающим списком. Для проточного цитометра существует очень много мышиных антител, с крысиными иногда имеются проблемы, потому что с ними не так часто работают, но антитела все равно имеются в тысячах и тысячах различных вариантов. На этом шаге мы выбираем вид живого организма, а затем добавляем информацию об используемых антителах. Если какие-то антитела от других производителей уже куплены и их нужно добавить в создаваемую панель, это можно сделать вот в этой вкладке и перечислить их здесь.

Далее вводится информация о флюоресцентных белках, если изучаемые клетки их экспрессируют, – например, если выполняются исследования в области CAR-T или неких других клеток, и в них вставка репортерного гена приводит к экспрессии белка GFP, – он будет «засвечивать» очень многие каналы, поэтому его здесь тоже можно учесть.

Далее необходимо перечислить антитела, которые требуется использовать. Для этого их нужно назвать или добавить новые, можно удалить из списка один и добавить другой.

Выбор удобно делать, начиная записывать в строке название интересующего антигена, который необходимо проанализировать – приложение дает подсказку, какие из них уже имеются на сайте.

С помощью ползунка нужно выставить предполагаемое количество этого антигена в рабочем образце.

Например, CD45 в очень больших количествах содержится в образцах крови. Некоторые редкие антигены, которые обусловливают редкие фракции, инактивированные натуральные клетки, регуляторные Т-клетки – таких антигенов мало. Регулировка с помощью этого ползунка позволяет программе рекомендовать исследователю соответствующие флюорофоры: например, менее интенсивные, если антигена много, и высокоинтенсивые флюорофоры – если антигена мало, его нужно детектировать. Если количество антигена в образце неизвестно, следует указать средний уровень.

На этом же шаге можно перечислить необходимые реагенты, например, для определения жизнеспособности и других параметров клеток. В открывающемся диалоговом окне можно выбрать, предполагается ли исследовать образец с фиксированной кровью или живой кровью без фиксации., Есть возможность подобрать красители на клеточный цикл, пролиферацию, а также определенные функциональные реагенты, в том числе на определение концентрации кальция, митохондриального потенциала, наличия активных форм кислорода. Таким образом, можно совмещать панели иммунопрофилирования и одновременно определять определенные биологические процессы внутри клеток.

Когда выбрана необходимая панель антигенов, антител, необходимые дополнительные реагенты, можно переходить к следующему шагу – выбору флюоресцентных меток для лазеров используемого проточного цитометра.

Количество точек в этом меню показывает количество флюоресцентных меток, которые для данного канала выбранного цитометра уже есть у нас на сайте.

Например для CD45 их очень много, – можно для него выбрать как традиционный краситель, например FIX – очень дешевые антитела, но зато менее стабильные, это нестабильный и не очень интенсивный краситель. И если в эксперименте необходимы красители действительно очень узкого спектра, интенсивные красители для многоплексных панелей, можно рекомендовать продукцию с меткой NovaFluor – эти красители появились в портфолио ThermoFS в 2021 году, они характеризуются очень узким спектром. Это позволяет использовать их в мультипанелях с большей эффективностью, а также, например, для спектральной цитометрии. Она сейчас приобретает все большую популярность,: поскольку позволяет использовать сразу десятки разных флюорофоров. При этом необходимо выбрать, какой флюорофор использовать для каждого канала. Здесь при выборе флюорофора система показывает, сколько будет «засвета» от соседних каналов на данном лазере, на сколько процентов соседние каналы «засвечивают» данный пик. Выбрать флюорофоры можно по их интенсивности, и пользователю будет показан спектр для конкретного белка, который предполагается детектировать.

Настройка второго лазера

Для второго лазера выбор флюорофоров производится аналогично. Например, можно порекомендовать Alexa Fluor – красители, с отличной по стабильностью и интенсивностью.

Созданная сейчас простая панель вряд ли оптимальна, потому что флюоресцентные метки мы выбирали практически наугад.

Обратите внимание на засвет двух каналов: если потратить чуть больше времени, можно подобрать их с большей эффективностью.

Впрочем, при детекции это не так сильно себя проявит, и можно будет потом эти метки с проточным цитометром автоматически скомпенсировать – разнест по спектрам.

Тем не менее, такая панель тоже имеет право на существование. Если кликнуть на этот график, где подобраны флюорофоры, программа сразу открывает интерактивный инструмент, который называется SpectraViewer. Пользователь может рассмотреть спектры и увидеть перекрывание этих спектров эмиссии флюорофоров. А затем подобрать какие-то другие, если требуется.

Следующий шаг после подбора флюорофоров – это немного глубже: - это подбор необходимых клонов, необходимых требуемых каталожных номеров. Для того же CD45 с меткой FITC существует буквально десяток различных конфигураций.

Если исследователь не знает, что выбрать и какой клон использовать, то можно выбирать любые рандомные клеточные клоны. Одна из рекомендаций – если есть сомнения в выборе, антитела следует подбирать по количеству ссылок на них в публикациях. Дело в том, что все публикации всех пользователей, упомянувших наши антитела в своих статьях, собраны системой из различных источников и объединены здесь. Фотографии, которые вы видите, в том числе изображения антител – все это взято из готовых статей. И можно сказать, что, например, если у некоего антитела 32 цитирования – значит, скорее всего, оно не самое плохое.

После этого создание панели завершено. Можно скачать соответствующий ей документ в формате pdf, содержащий детальную информацию о панели. Когда уже будет проводиться эксперимент на цитометре, такие данные очень полезно иметь под рукой, поскольку в них будет указано, на каком лазере какой канал выбирать, какие метки задавать. И будет доступна информация о пересечении спектров и их «засвете» друг относительно друга.

Можно эту информацию экспортировать и в табличном формате – и отправить для заказа дистрибьютору, чтобы он сформировал соответствующее коммерческое предложение.

Панель можно сохранить для дальнейшего использования и модификации. Этот инструмент позволяет всегда интерактивно просматривать новые флюорофоры, всегда содержит информацию о новинках, которые появляются на сайте, и всегда будет их вам рекомендовать, что тоже представляет удобство для пользователя