Проточная цитометрия с Thermo Fisher Scientific

• Проточный цитометр Attune NxT
• Экспериментальная часть

Проточный цитометр Attune NxT

Проточный цитометр Attune NxT, используемый в нашей экспериментальной части, представлен в очень хорошей конфигурации – у него произвольно конфигурируемая оптическая система, так что пользователь может заказывать те каналы, которые необходимы.

Большинство каналов здесь уже установлены: можно посмотреть, какие здесь фильтры установлены, но понимая, что вся оптическая система конфигурируется произвольно.

Для примера мы сегодня будем эти светофильтры заменять, чтобы проанализировать цельную кровь, которую при анализе вообще лизировать не будем, а проведем исследование белой крови вместе с эритроцитами. У эритроцитов есть ген, который немного флюоресцирует, если на него фиолетовым лазером посветить, и мы можем таким образом эритроциты по их автофлюоресценции в фиолетовом лазере отделить и анализировать интактную кровь.

Фильтры легко меняются, есть готовые наборы фильтров, есть также просто рамки, которые вы можете купить и в такую рамку вставить вообще любой фильтр.

Слева находится жидкостная часть инструмента, здесь же сток для его отходов. При выполнении исследований на приборе используется проточная жидкость, причем в пересчете на объем образца ее требуется совсем мало.

Например, примерно полтора литра этой жидкости тратится на день активной работы. С учетом того, что прибор может анализировать образцы с очень высокой скоростью – 1000 микролитров в минуту (примерно в 10 раз быстрее, чем у аналогичных других проточных цитометров, присутствующих на рынке), он действительно расходует очень мало реагентов и в целом экономичен.

Если необходимо, вы можете эти банки даже не снимать, а просто взять и долить туда немного проточной жидкости либо каких-то еще других технических жидкостей.

Если какого-то из этих жидких компонентов будет недоставать, прибор об этом сообщит и просто приостановит эксперимент: пользователь должен долить соответствующую жидкость, чтобы продолжить. После долива прибор продолжит выполнение эксперимента с той точки, на которой остановился.

На приборе используется автосэмплер – система автоматической подачи планшетов и образцов. Его удобство заключается в том, что не нужно переключаться между разными типами образцов, и в одном процессе можно одновременно работать и с пробирками, и с цитометрическими «эппендорфиками» (пробирками типа Эппендорф), и также одновременно еще и с планшетом, что-либо совмещая в нем.

Автосэмплер работает очень быстро, и проводимый нами эксперимент нацелен на то, чтобы показать скорость работы автосэмплера. У него есть различные алгоритмы и методы работы, но сегодня наша цель – продемонстрировать самую высокую скорость – на тысячу микролитров в минуту при небольшом объеме образца. Можно также задать точный режим, при котором прибор будет многократно перемешивать образец, и промываться между образцами.

Чтобы использовать здесь образцы живые или «полуживые», есть охлаждаемые блоки: если такой блок выдержать в холодильнике в течение нескольких часов, он потом в течение очень длительного времени будет сохранять температуру: внутри у него залит этиленгликоль, который очень долго сохраняет температуру, – и исследуемый образец будет охлаждаться. Это важно. Хотя у данного проточного цитометра автосэмплеры быстрые, и потому анализ целого планшета может занять всего 20 минут, но, если исследуются большие объемы образцов и проводится некое долгое исследование, то образец можно охладить.

Экспериментальная часть

Экспериментальную часть начнем с демонстрации необычной конфигурации прибора, которая сейчас все чаще используется – это боковое светорассеяние в фиолетовом лазере. Для этого нужно заменить здесь пару оптических фильтров, которые вызовут свечение эритроцитов. И тогда можно проанализировать такой образец цельной крови, который немножко разведен. Если кровь лизировать, она выглядит совершенно прозрачной, а в данном случае она слегка опалесцирует, поскольку здесь действительно содержится большое количество эритроцитов.

Для анализа этого образца в уже существующий эксперимент на компьютере «добавляем новый образец», легко настраиваем скорость в диапазоне от 12,5 мкл в минуту до 1000 мкл в минуту. В данном случае мы проанализируем 200 мкл со скоростью 100 мкл в минуту. Прогон образца начат.

Интерес представляет получаемый при работе прибора график, где мы видим огромную популяцию эритроцитов, которые отделены от популяции «белой крови». Отдельно на графике будут располагаться гранулоциты, лимфоциты и тромбоциты. Все «белые» составные части крови находятся в одном месте, а эритроциты – отдельно.

Проточный цитометр ведет абсолютный подсчет событий и в ходе этого эксперимента сообщил, что собрал практически 12000 событий. Если необходимое количество событий собрано, можно приостановить сбор данных. Более того, неиспользованный образец можно вернуть в новую пробирку, что важно для работы с ценными, редкими образцами. Если образца мало, можно проанализировать только его часть, а остаток потом использовать, например, для пассажей, культивирования, трансфекции и других целей.

Если необходимо вернуть все эти 129 мкл, которые находятся во внутренней петле инструмента, следует нажать кнопку Recover. Прибор попросит пользователя загрузить пустую чистую пробирку, а мы в данном случае поставим ту же самую, в которую хотим вернуть образец. Нажимаем кнопку Next, – и проточный цитометр начинает возвращать образец обратно в пробирку. Это особенно наглядно, когда объемы образца достаточно большие.

Прибор автоматически промывается между анализом разных образцов, так что работа пользователя здесь минимальна. Например, я только немного протру пробозаборник.

Прибор тем временем промывается автоматически. После этой автоматической промывки он собрал миллион событий. Из этого миллиона белой крови – примерно 13 тысяч.

Сохраним этот образец. После сохранения можно сразу посмотреть концентрацию. За счет наличия шприцевой помпы пользователю не нужно использовать калибровочные частицы. Он знает, какой объем проанализирован, сколько там частиц, тоже известно, и система сразу сообщает данные.

Этот образец покрашен CD45, и здесь можно четко увидеть именно лимфоциты в виде этого «облачка», а далее другие клетки: гранулоциты, тромбоциты. Можно не довольствоваться только одним антителом, а использовать действительно целую панель – в таком случае даже цельную кровь, интактную, можно анализировать сразу с использованием очень большого количества различных антител.

А теперь подготовим планшет для анализа на автосэмплере.

Для этого потребуются: планшет, дозатор, калибровочные частицы – (неокрашенные и окрашенные) с разными интенсивностями окраски: средне, сильно и очень сильно окрашенные образцы.

Заполним несколько лунок этими частицами, и мы сможем посмотреть на скорость и принцип работы автосэмплера, в том числе процесса автоматизации анализа данных. Это очень ценный инструмент, если необходимо делать скрининги.

Помимо частиц нальем сюда обычную проточную жидкость, чтобы увидеть, насколько прибор контаминирует образцы в этом быстром режиме. Можно установить точный режим – тогда между образцами он будет значительно более глубоким образом промываться, и кросс-контаминация между разными образцами будет минимизирована. В технических спецификациях указано, что контаминация между образцами в быстром режиме составляет около 1%, а в точном режиме – менее 0,5%. На самом деле он заносит и переносит очень незначительное количество событий между образцами.

Загружаем планшет в автосэмплер, а затем настроим настраиваем сбор данных. Для этого создадим новый эксперимент, – совершенно пустой. Зададим на плашке те лунки, в которых у нас находятся образцы, и те, где они отсутствуют.

У нас будет задействовано меньше четверти планшета. В быстром режиме прибор анализирует целый планшет из 96 лунок примерно за 20 минут. Здесь же будем собирать всего по 20 мкл с каждой лунки. В принципе, частиц там очень много, и этого будет достаточно для анализа образца. Зададим максимальную скорость анализа образца – 1000 мкл в минуту. Тогда получится, что на прогон этих 20 мкл у прибора уйдет примерно полторы секунды на каждый образец, плюс перемещение между образцами, – итого на запись таким образом заполненного планшета уйдет минуты 4.

Прибор промывается после предыдущего образца, заходит в автосэмплер и начинает сбор данных. Образец он может перемешивать – сейчас он делает это один раз, но можно настроить так, чтобы сделать перемешивание многократным, чтобы обеспечить большую его гомогенность и более точный анализ.

Здесь ведется абсолютный подсчет событий: вот в одной лунке 740 гиперинтенсивных событий, а здесь их 12. Система сразу же создает тепловую карту, и можно смотреть, как изменялся тот или иной процесс в плашке. Например, насколько активно шло накопление мертвых клеток при добавлении токсичной субстанции, насколько другие процессы, к примеру, иммунные, – менялись количественно. Отметим, однако, что быстрый режим не отличается высокой точностью.

Если необходима повышенная точность и меньшая дисперсия между техническими репликами, то выберем «долгий» режим. За час в таком режиме прибор проанализирует 96 образцов. Кто работал на проточном цитометре, тот знает, что если 96 образцов вручную подавать в прибор, это займет просто чудовищное время. Автосэмплер значительно упрощает работу и автоматизирует анализ.

Мы видим, что есть лунки полные, где очень много частиц, а есть лунки отрицательные – где, на самом деле, была не только проточная жидкость, но еще и какое-то количество частиц, которые перенесены из образца в образец на носике, которым осуществляется отбор образца.

Если образцы хранятся в холодильнике, то можно даже не вскрывать их при анализе, а просто заклеить фольгированной пленкой: тогда носик, который забирает образец, может еще и прокалывать пленку – он очень чувствительный.

Здесь везде практически одинаковое количество событий. Мы можем посмотреть не просто абсолютный подсчет, но и затем концентрацию событий в каждой лунке.

Вот прибор сообщает пользователю, сколько у него времени занимает анализ и сколько осталось до окончания эксперимента. Если в ходе эксперимента закончится проточная жидкость, прибор просто приостановит анализ и будет дожидаться, пока вы дольете необходимую жидкость. Полностью эксперимент не остановится, он только частично прервется.

Вот прибор завершает анализ последней лунки.

Везде он перенес примерно одинаковое количество событий он перенес вот в эти пустые лунки. Рассматриваем результаты и видим: вот негативные лунки, а это лунки, где были частицы – окрашенные и неокрашенные. Причем окрашенные частицы подразделяются на несколько популяций: есть слабоокрашенные, средне и очень интенсивно окрашенные. И на тепловой карте, которая изображена здесь, я показываю абсолютные количества интенсивных частиц. Но, если потребуется, здесь можно показать не количество, а, например, концентрацию.

Концентрация приведена в абсолютных значениях, а можно тепловую карту немного адаптировать, чтобы она показала распределение по концентрациям на приведенном образце. Концентрация минимальна в пустых лунках и максимальна в образцах с какой-то дисперсией между ними.

Этот эксперимент наглядно демонстрирует возможности проточных цитометров ThermoFS.