История
История
На вебинаре 21 октября 2021 г. Диана Дроботова, ведущая направление по генотипированию в компании Thermo FS, рассказала о применении геномных технологий в животноводстве, рассмотрев проблемы и особенности селекции сельскохозяйственных пород и перспективы агрогеномики в ускорении селекционного процесса.
Действительно, новые технологии, о которых пойдет речь, активно внедряются на российский рынок не только в институты, но и в животноводческие хозяйства. Это общеевропейская и даже общемировая тенденция, и последние достижения науки незамедлительно проникают в практическую сферу.
Геномные технологии в животноводстве и растениеводстве помогают улучшить генофонд, получить животных или растения с улучшенными характеристиками, а также максимально снизить количество различных врожденных аномалий и мутаций.
Достижения в геномике позволяют улучшить и ускорить селекционные программы, позволяя сэкономить и расходы. и время на получение нового организма с улучшенным генофондом. Путь к целевому организму может быть сокращен на несколько лет, поскольку сразу после рождения животного или получения нового растения можно на основе генотипирования предсказать, какими характеристиками будет обладать этот организм, стоит с ним далее работать или нет. Теперь можно выбрать направленную селекционную концепцию и принимать эффективные селекционные решения. А главное – открывается возможность с помощью геномной оценки получать популяции с максимальной чистотой генов – с заданными признаками, но без генетических заболеваний.
Анализ рынка современных технологий показывает, что на 2021 г. рынок маркер-ассоциированной селекции составляет около 740 млн долларов (серый прямоугольник на диаграмме), а к 2026 г ожидается его рост в полтора раза. Ожидается рост в полтора раза и для рынка генотипирования. По другим родственным технологиям прогнозы отличаются не намного: показатели подтверждают, что все эти направления развиваются семимильными шагами. Если говорить об области применения генотипирования или геномных технологий, следует отметить следующее.
Индекс племенной ценности – возможно, главный фактор в использовании геномных технологий. Происходит оценка животных или растений на ранних стадиях развития – почти сразу после рождения. При этом можно сделать выбор сорта или породы с лучшими характеристиками – теми, которые нужны для использования в конкретных программах селекции.
Выявление хозяйственно полезных признаков: зная какие маркеры связаны с определенными характеристиками организма, селекционер может выбирать животных с нужным цветом глаз, окраской меха, нужными показателями качества мяса, плодовитостью, фертильностью, конверсией корма, устойчивостью к болезням, климатическим условиям и лекарственным препаратам и т.д.
Получение животных без генетических заболеваний стало возможным потому, что теперь можно на ранних стадиях отсекать развитие животных или растений, у которых есть мутации, приводящие к генетическим аномалиям, даже не заметным визуально сразу после рождения.
Подтверждение происхождения – это основное направление работы многих лабораторий, производящих оценку чистопородности, доказательство происхождения, определение породы и популяции. Эти характеристики важны с экономической точки зрения, например, при закупках и продаже, в том числе в международной торговле, потому что оценка происхождения может обеспечить прослеживаемость принадлежности вплоть до страны происхождения или региона разведения либо выращивания организма.
Непосредственно селекционно-племенная работа – это научная часть работы в аграрном секторе, связанная с ведением направленного скрещивания. Полногеномный поиск ассоциаций (GWAS) позволяет найти новые маркеры, связанные с хозяйственно-племенными признаками, что важно опять же для расширения показателей индекса племенной ценности.
Основа генотипирования, геномной селекции – единичные полиморфизмы. Известно, что от сотен тысяч до миллионов однонуклеотидных полиморфизмов (SNP, «снипов») охватывают весь геном животного или растения. Часть из них связана с определенными признаками, с фенотипом.
Поиском новых SNP или валидацией уже открытых и занимается генотипирование.
Оно позволяет получить нужную информацию о генах и связанных с ними полиморфизмамах, проводить GWAS – так называемый поиск ассоциаций между полиморфизмами и фенотипом, и как следствие – вычислять индекс племенной ценности
Важно, что на первичном этапе работы по поиску этих маркеров и валидации маркеров, которые связаны с нужными качествами, очень важна плотность количества SNP, по которым генотипируют животных: чем больше SNP, тем точнее анализ.
Для чего это нужно?
В примере, связанном с генотипированием птиц, можно сказать, обобщая выводы и на другие организмы: необходимость чипа высокой плотности вызвана стремлением к максимальному охвату задач в области селекции (выявлению генетических ассоциаций со сложными признаками, тонному картированию локусов количественных признаков QTL, анализу генома для селекции, реализации геномного отбора GS по видам). Высокая плотность чипа расширяет применение технологии для различных видов и пород, позволяет шире охватить микрохромосомы, улучшает прогностическую эффективность геномных оценок с использованием генетического неравновесия по сцеплению (LD)
Есть такое понятие как генетическое неравновесие по сцеплению. Считается, что для полноценного GWAS – поиска ассоциаций полиморфизмов с признаками, то есть первичного этапа селекционной работы – требуется более 100 тысяч SNP. Если говорить о технологиях микрочипов – это чипы высокой плотности, необходимые, чтобы анализ и результаты были максимально точными.
Если говорить об определении родства и чистопородности, сейчас организациями общества ISAG рекомендованы STR – немного другой вид маркёров (микросателлитные повторы), на которых в настоящее время в основном сфокусирован генетический анализ для овец, крупного рогатого скота, кошек, собак, лошадей, в свиноводстве. Для их детекции требуется капиллярный электрофорез. Но тот же ISAG теперь настойчиво рекомендует переходить от STR к SNP – анализу единичных полиморфизмов, потому что они точнее и активно используются при решении тех же задач в сельском хозяйстве.
Между двумя этими подходами есть весьма сильное различие. Связано оно с простотой в интерпретации при использовании SNP (только две аллели: получаем результат как «гомозиготный А или В» или «гетерозиготный»). Высокопроизводительное генотипирование повышает точность: например, при анализе родства можно рассмотреть 200 SNP вместо 20 STR. И при поиске маркеров родства задействовано 500-800 «снипов».
В 2020-м вышло решение Евразийской экономической комиссии о том, что при осуществлении торговли животными внутри Евразийского экономического союза необходимо тестировать животных на определенные количество заболеваний, генетические аномалии, определяя STR. Но в этом же решении указаны SNP, которые служат альтернативой данной технологии. И в Российской Федерации SNP также официально включены в документы, эти маркеры можно исследовать в генетической экспертизе племенной продукции. Как видно на иллюстрации, в приложении приведены оба перечня – STR- и SNP-маркеров для проведения молекулярной генетической экспертизы с целью достоверности происхождения племенных животных.
ThermoFisher Scientific предлагает широкий спектр решений для любых задач. Независимо от того, какие задачи стоят перед потребителем – полногеномное секвенирование на первоначальном этапе, геномная селекция, маркерассоциированная селекция, определение родства или контроль качества – в зависимости от количества маркеров можно предложить те или иные современные подходы.
ThermoFS была пионером в технологии микрочипов. Сама эта технология была представлена рынку в США в середине 80-х компанией Affymetrix. Несмотря на то, что сейчас она вошла в состав ThermoFS, на российском рынке продукция Affymetrix недостаточно известна, что связано прежде всего с фокусировкой компании на американском рынке: у нее не было задачи глобализации. Однако с развитием технологии и спроса на соответствующие решения эту продукцию стали продвигать на европейском рынке примерно с 2010 года – конечно, существенно позже, но сейчас на этом рынке эта технология успешно внедряется. В России продвигать эту технологию начали только в 2021-м, и делает это команда по генотипированию, созданная в ThermoFS.
Спектр возможностей современных геномных технологий на основе микрочипов действительно очень широк. Прежде всего следует разграничить области применения микрочипов и таргетного NGS. Выбор подхода зависит от количества маркеров.
На первом этапе геномной селекции, когда исследователь еще не знает, какие маркеры ему нужны и интересны, необходимо задействовать микрочипы. В это время ведется работа либо с неизвестными маркерами для поиска их связи, ассоциации с какими-либо признаками фенотипа, либо работа с известными маркерами и для скрининга животных или растений (например, неких местных пород или сортов). В любом случае первичная задача – это скрининг по максимальному количеству полиморфизмов, поэтому используются чипы высокой плотности.
Если перейти к количественным показателям, то граница пройдет так:
- от 5 тысяч до миллиона – микрочипы, технология Axiom;
- от 100 до 5000 маркеров – таргетное генотипирование с использованием NGS, технология AgriSeq.
Микрочипы (ДНК-чипы) представляют собой плашку по размеру 96-луночного планшета, разбитую на лунки – ячейки с квадратиками. Каждая ячейка покрыта специальным фоточувствительным слоем, на который методом фотолитографии наносятся ДНК-зонды, комплементарные определенным участкам исследуемой ДНК, где находится искомые полиморфизмы. Эта ячейка состоит из миллионов одинаковых повторяющихся зондов. Например, если рассматривать чип высокой плотности, ячейку делят на сотни тысяч квадратиков размером 5 микрон на 5 микрон.
Другие технологии чипов, распространенные сейчас на рынке, имеют определенные ограничения.
Самый яркий пример – это технология с использованием микрочастиц. При производстве чипов у других производителей используется пул частиц. Зонды присоединяются к специальным частицам – шарикам, а затем, когда производится покрытие чипа, этот пул частиц наносится рандомным способом. Соответственно, часть этих частиц просто вылетает, не доходит до своих мест прикрепления лунок на чипе, и получается, что примерно от 5 до 20% маркеров на таких сторонних чипах теряется. Поэтому пользователь, который заказывает себе условные 50 тысяч маркеров, в реальности получает гораздо меньше ввиду ограничения технологии.
Это ограничение конкурентных технологий стало отправной точкой того, почему сейчас такую популярность получила в Европе технология Axiom, действительно обладающая определенными преимуществами.
Первое из них – всегда 100-процентный контент. При изготовлении чипов с контентом пользователь может быть уверенным, что если он заказал 800 тысяч маркеров, то он получит именно 800 тысяч маркеров – потерь маркеров не будет, ни о каких выпадениях в объеме 20% речь не идет. Это преимущество обеспечено технологией фотолитографии, когда синтез зонда идет под контролем в режиме реального времени: видно, в какой точке, в каком месте присоединяется тот или иной нуклеотид.
Это важно потому, что при первоначальном скрининге, где, по некоторым мнениям, допустима какая-то потеря маркеров и потому она не считается важной, но в дальнейшем она может сыграть свою роль. При переходе к индивидуальным пользовательским (кастомным) решениям, когда уже сделаны выводы о том, что по итогам скрининга выявлены важные в конкретной ситуации маркеры, потери не должно быть: это те самые маркеры, которые пользователь выбрал, и их потеря будет означать потерю места на чипе, а значит – увеличение стоимости анализа и тестирование образца по меньшему количеству маркеров.
Thermo FS работает со сложными алгоритмами. По использованию программного обеспечения от Thermo существует отдельный тренинг, длящийся примерно час, но если говорить кратко – сам софт Thermo FS представляет собой мощный инструмент, позволяющий работать со сложными геномами и случаями, например, биаллельности, высокой доли GC оснований в составе, близкого расположения полиморфизмов, гомологии/псевдогенов и так далее.
Говоря о SNP т полиморфизмах, не следует забывать о других видах маркеров, таких как инсерции, делеции, вариации числа копий генов, которые в животноводстве также связаны с определенными признаками.
У команды биоинформатиков Thermo есть интересные исследования, в которых были найдены вариации числа CNV, связанные с крутизной рогов у животных. Этот маркер вызвал интерес у заводчиков, они обратили на него внимание.
Данные, полученные с использованием технологии Axiom, можно перевести в формат Long Format – то есть формат Illumina, чтобы сравнить данные, полученные на Axiom и Illumina.
Данные Axiom можно легко перевести в формат, позволяющий загрузить их в базу данных Совета по молочному скотоводству (CDCB).
Кроме того, у Thermo FS есть дополнительные пакеты, которые помогают автоматически анализировать диплоидные и полиплоидные виды – это особо актуально для растений. Вся эта работа проводится в автоматическом режиме.
ThermoFS предлагает три формата:
- 96 образцов – чип высокой плотности, несколько сотен тысяч маркеров;
- 384 образца – чип средней плотности, около 65 тысяч маркеров;
- «Мини-96» – 96 образцов с таким же контентом, как в формате 384, но для использования меньшего количества образцов. Он пригоден для рутинных задач, когда образцов не так много.
«Сердце» системы – сканер микрочипов GeneTitan Multi-Channel Instrument. Эта система позволяет производить в автоматическом режиме большинство этапов высокопроизводительного генотипирования (от нескольких тысяч до 850 тысяч маркеров и более): этап гибридизации, окрашивания, получения изображения. Высочайшая производительность прибора сводит к минимуму ручную работу, то есть вмешательство пользователя, и позволяет одновременно обрабатывать большое количество образцов без присутствия оператора.
Система использует разные виды микроматричных планшетов: с 24, 96 и 284 лунками. Микроматричный планшет система готовит за 5 минут, сокращая время работы до 30 минут. Прибор имеет встроенный сканер с внешней высокоинтенсивной ксеноновой лампой и двойные фильтры обогащения и излучения.
Рабочий процесс, схема которого представлена выше, занимает около 5 дней с момента выделения пробы, включая амплификацию, гибридизацию, связывание, получение сигнала. В среднем все эти процессы занимают около недели.
При этом ручная пробоподготовка минимальна: оператор не стоит в лаборатории с утра до вечера. Чтобы раскапать плашку и внести реагенты, обычно требуется около часа в первый день, затем приложить определенные усилия во второй день. Далее чип загружается в GeneTitan.
При этом ручная пробоподготовка минимальна: оператор не стоит в лаборатории с утра до вечера. Чтобы раскапать плашку и внести реагенты, обычно требуется около часа в первый день, затем приложить определенные усилия во второй день. Далее чип загружается в GeneTitan.
Thermo FS располагает самым большим каталогом микрочипов. Если просуммировать готовые чипы и пользовательские решения, изготовленные для партнеров, это не даст исчерпывающего списка продукции, а составит лишь его небольшую часть, поскольку многие компании не готовы открыто делиться информацией о том, какие чипы от каких производителей они используют, и потому связанная с ними продукция не фигурирует в информационных материалах Thermo FS, что не отменяет активного международного партнерства компании по всему миру.
Если пользователь не нашел в каталогах готовый чип под свои задачи, то в ход идет вторая сильная сторона Thermo FS – причина столь активного развития технологии в Европе. Это кастомизация продукции – работа с индивидуальными решениями.
Еще на старте долгой работы автора этого доклада в генотипировании – когда это направление только начинали продвигать в России – самым главным вопросом была помощь в изготовлении кастомных чипов (с индивидуальным дизайном). В этой работе требовалась биоинформатика: лаборатории чаще всего сталкиваются с тем, что в их распоряжении нет готового списка маркеров, особенно когда работа только начинается. Поэтому у Thermo FS есть своя команда биоинформатиков, и с их участием пользователь может рассчитывать на помощь в разработке кастомного чипа на этапе выбора маркеров, его валидации и изготовлении. Пользователь может рассчитывать на то, что наших специалистов не остановят трудные геномы при разработке, а также на точность и постоянство при изготовлении разработанных чипов и возможность делать минимальные заказы.
Вот как выглядит процесс разработки индивидуального чипа.
Thermo берет пользовательский контент, контент из открытых источников либо из собственной базы генотипов. Из этого обширного набора отбираются маркеры четырех типов, которые нужно исследовать. После этого изготавливается чип.
При индивидуальном дизайне чипа имеет значение объем партии. поскольку у Thermo FS есть собственное производство и компания ни от кого не зависит, все этапы создания чипов осуществляются самостоятельно. Это позволяет серьезно сократить минимальный объем партии кастомных чипов.
В зависимости от формата это может быть чип высокой или средней плотности – начиная условно от 500 образцов, то есть пять плашек – это уже может быть кастомный чип.
После того, как маркеры выбраны, нет гарантии того что этот теоретически сделанный выбор оправдает себя на практике и эти маркеры будут работать, решая нужную задачу. Чип не запускается в работу, пока не на стороне разработчика не убедились в эффективности этого спроектированного чипа. Его валидация может быть проведена лаборатории, чип можно проверить на реальных образцах – это так называемый демо-кастомный чип. Только если результат удовлетворителен, запускается производство большой партии – так снижается риск, что пользователь получит сразу большую партию плохо работающих чипов.
Биоинформатики помогают клиентам не только на первом этапе, но и на последнем, когда нужно проанализировать данные.
Недавно для селекционного центра крупного свиноводческого хозяйства выполнялась работа, в рамках которой биоинформатики Thermo FS в качестве примера рассмотрели полученные данные и предоставили отчет с GWAS. Там было не так много образцов – постановка была демонстрационной, тем не менее биоинформатики нашли два маркера, которые с высокой долей вероятности были связаны с определенными фенотипическими признаками.
Кроме того, возможно изготовление смешанных чипов – помещать разные объекты, объем которых не ограничен, поскольку есть ограничение только по общему количеству маркеров. Это актуально для институтов, где есть несколько лабораторий, и для центров коллективного пользования.
Так выглядит прибор, в настоящее время активно используемый московской генетической лабораторией «Геномед», которую можно посетить. чтобы ознакомиться с технологией, увидеть, как это работает на практике, задать сотрудникам специфические вопросы. Эта команда открыта к сотрудничеству, сейчас почти каждые две недели запускается прибор: в лабораторию приезжают представители институтов, частных хозяйств, смотрят на процесс, сравнивают данные. Можно даже отправить образцы, которые уже были прогенотипированы на Illumina, к нам, сравнить данные, пообщаться по программному обеспечению – Thermo FS также готов к взаимодействию.
Ссылки на остальные части вебинара
Геномные технологии в программах селекции в животноводстве. Часть 2.
Геномные технологии в программах селекции в животноводстве. Часть 3.
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
