Содержание статьи:
На вебинаре 21 октября 2021 г. Диана Дроботова, ведущая направление по генотипированию в компании Thermo FS, рассказала о сути технологии NGS и ее применении для генетического контроля здоровья домашних животных, генотипирования и диагностики моногенных и мультигенных наследственных заболеваний.
Общие характеристики и применение технологии AgriSeq
После выбора маркеров по технологии Axiom круг поиска сужается и можно перейти к работе с этими целевыми маркерами, задействовав технологию AgriSeq – таргетное генотипирование методом NGS. Его целесообразно применять именно при небольшом количестве маркеров – чаще всего в рутинных диагностических исследованиях, ставящих своей целью еще и снижение себестоимости анализа одного образца.
В Thermo FS решил такую задачу за счет использования специальной химии, позволяющей удешевить стоимость анализа одного образца с плотностью от 100 до 5000 маркеров. Впрочем, наибольшая эффективность ощутима в диапазоне от 100 до 2000 маркеров, поскольку уже при их количестве выше 3000 не исключено, что микрочипы окажутся выгоднее. Новые разработанные реактивы используются на проверенной временем технике в программах маркер-ассоциированной селекции. При этом Thermo FS обеспечивает комплексное решение задачи: ресурсы, биоинформатика, сервис, реагенты и оборудование, необходимое на стадиях от выделения ДНК с контролем качества до получения данных и их обработки. Благодаря разработанной методике увеличивается точность отбора и повышается эффективность исследований для ускорения селекционно-племенной работы.
Основные преимущества технологии AgriSeq:
- использование мультиплексной химии и полупроводниковых микрочипов, позволяющих анализировать образец по 100-5000 маркеров, среди которых SNP, инсерции и делеции – как и в случае с микрочипами;
- баркоды позволяют обрабатывать до полутора тысяч (1536) образцов за один прогон, но так как секвенатор можно загружать два раза, то условно до 3000 образцов можно генотипировать каждый день. В одном запуске (прогоне) можно совмещать разные панели – для разных животных и разные типы маркеров;
- Длина прочтения составляет 200 пар оснований. В пределах этой последовательности исследователь может автоматически определять какие-то новые неожиданные полиморфизмы, а программное обеспечение позволяет автоматически определять генотипы.
Методика использует проверенную временем и успешно зарекомендовавшую себя на российском рынке технологию полупроводникового секвенирования. Многие пользователи работают с секвенаторами. Напомним, что определение последовательности производится по изменению pH – при присоединении нуклеотида выделяется ион водорода и меняется pH раствора, это детектируется прибором и на основе этой детекции строится сиквенс. При этом на каждом чипе происходят миллионы реакций секвенирования.(рис. 1)
Результат при использовании такой методики можно получить за 2-3 дня (включая выделение, построение библиотек и получение данных) в зависимости от используемого оборудования и чипа. Ручная подготовка минимальна. Основной этап – построение библиотек: это примерно 3 часа ручного труда или час автоматизации. Дальше основные этапы – темплирование и сиквенс – проводят приборы.
Темплирование, обогащение и загрузка чипов проводятся на станции и Ion Chef System(рис. 2).
Thermo FS предлагает три вида секвенаторов – это классический Ion GeneStudio S5, но в трех разных конфигурациях в зависимости от того, какие чипы используются (Ion 510, Ion 520, Ion 530 или выше): это собственно S5, Ion GeneStudio S5 Plus или Ion GeneStudio S5 Prime(рис. 3).
В зависимости от количества маркеров поставщик поможет пользователю выбрать один из трех вариантов. Обычно рекомендуется S5 Prime или S5 Plus, потому что S5 Prime работает с новым чипом от Thermo FS Ion 550 Chip, у которого максимальная емкость (100-130 млн прочтений, до 200 пар оснований), а S5 Plus – это базовый прибор.
Что важно и что нравится пользователям, так это отсутствие необходимости как-то апгрейдить систему. Покупая один прибор, в зависимости от задач можно выбрать чипы разной емкости. Например, когда образцов очень много и поставлена задача заработать с большим количеством маркеров, можно выбрать чип Ion 540, максимально подходящий к этому секвенатору. Если оказалось, что задач меньше, меньше образцов и маркеров, можно остановиться на менее емком чипе, чтобы соответствующим образом скорректировать себестоимость анализа.
Емкость чипа вычисляется по формуле. Получая запросы, мы узнаём, какое количество образцов предполагается в прогоне и каково количество маркеров, потому что эти два показателя наиболее важны. Количество маркеров умножают на количество образцов на чип и учитывается покрытие. Обычно рекомендуется использовать покрытие 100. Можно брать меньше, но при использовании значения 100 есть гарантия, что все данные будут достоверны. Итак, произведение этих трех значений дает емкость чипа.
Это важно: если мало количество маркеров и образцов, то вся емкость чипа не будет использована, и это повысит себестоимость анализа.
На этом этапе идет выбор чипа, оптимального для исследования.
Таблица, приведенная ниже, отражает итог огромного количества исследований. Средняя доля выявленных генотипов по разным животным достаточно высока: обычно 99, для крупного рогатого скота 97-98, при этом важно, что средняя доля выявленных генотипов у Thermo FS выше, чем у других аналогичных технологий, представленных на рынке. Есть достаточно много публикаций, позволяющих говорить об этом уверенно.
И это не все чипы, которые предлагает Thermo FS. Сейчас компания предлагает около 130 кастомных панелей – а надо отметить, что технология и химия AgriSeq были анонсированы достаточно недавно – год-полтора назад (на 2021 год), и за такой отрезок времени можно отметить, что разработки новых панелей ушли от нуля очень далеко и продолжают развиваться: аквакультура, растения, по которым сейчас даже больше панелей, в Европе на это настоящий бум. И по животным тоже количество панелей растет(рис. 4).
Аналогичный подход в данном случае и у биоинформатики. Компаний помогает выбрать маркеры. Здесь это проще: маркеров меньше, поэтому есть возможность, к примеру, отправить образцы в «Геномед» и прогнать на чипе высокой плотности, как это обычно происходит, затем пользователь выбирает маркеры, которые ему интересны, добавляет какие-то свои, и в Thermo FS готовят демо-чип, проверяют его. Изготовление панели в среднем занимает 4-6 недель – это самое короткое время на рынке: в течение месяца с небольшим пользователь получает готовую панель, а это важно, когда нужен срочный скрининг, особенно в конце года. Соответственно, биоинформатики на всех этапах готовы помочь.
Акцент – на индивидуальные потребности исследователей
(рис. 5)
На сегодня готовых панелей у Thermo FS немного, поскольку компания делает акцент на кастомные панели (индивидуального дизайна). Есть панели по собакам, кошкам, конечно же, по КРС, с маркерами, рекомендованными ISAG по SNP, это недавняя новая панель по лошадям, панель по овцам с маркерами SNP, что указано в документах Таможенного союза, и огромное количество панелей по аквакультуре – всего более 180 кастомных панелей.
Клиенты спрашивают, есть ли ограничения по минимальному числу маркеров при заказе панели AgriSeq. На практике минимум составлял 50-100, ограничений как таковых нет – они только в емкости чипа и себестоимости анализа. Чем меньше маркеров, тем дешевле кастомная панель, соответственно, больше количество образцов потенциально можно разместить. Минимального числа маркеров нет, главное – вопрос эффективности такого небольшого их количества.
Для готовых панелей Thermo FS может предоставить описание маркеров, отправив сообщение по электронной почте. Общий подход: к каждому чипу и панели есть описание, файл-аннотация в свободном доступе, а также файл Excel, в котором будут перечислены наименования и расположение маркеров и описание, если они связаны с какими-то признаками. Для AgriSeq это список болезней, список родства, это другие маркеры, все это возможно для разных животных.
Панели можно комбинировать в одном запуске, используя на одной панели разные маркеры. Биоинформатика – это сильная сторона Thermo FS, заключающаяся в соответствующей поддержке пользователей.
Ознакомиться с технологией можно непосредственно в Москве: среди нескольких проектов сегодня Thermo FS сотрудничает с академией имени К.И. Скрябина – лабораторией молекулярной генетики и геномики птицы, которая дала добро на то, чтобы сейчас к ним отправляли к ним образцы для генотипирования и новые пользователи могли ознакомиться с технологией.(рис. 6)
NGS в разведении мелких домашних животных
(рис. 7)
Описанный выше подход применим и к генотипированию мелких домашних животных. В нем основной акцент сделан на:
- диагностике, обнаружении наследственных заболеваний (рецессивных мутаций и генетических аномалий), причем именно тогда, когда их не видно при рождении, а также обнаружение моногенных и полигенных заболеваний;
- экстерьер и морфологию: все, что связано с внешним видом – окрас, длина шерсти, цвет глаз, группа крови, объем мышечной массы, тип походки;
- определение родства для создания генетического паспорта и идентификации животного;
- кормление: это тоже интересная область применения: можно определять возможность использования специфических кормов, аллергию и наличие пищевых особенностей.
Диагностика (поиск известных маркеров, каждый из которых связан с болезнью или признаком) – только одна сторона использования технологий NGS в разведении мелких животных.
Другая сторона – поиск новых признаков и новых маркеров, оценка животных для получения потомства с какими-то особыми свойствами, улучшенными характеристиками, то есть использование в программах селекции.
Интересное современное применение в специфических целях – поиск маркеров, которые ассоциированы с особенностями поведения животных – например, наличие агрессии (отбор собак-поводырей), селекция собак, которые расположены к детям (не агрессивны) и так далее.
Особняком стоит среди этих задач поиск маркеров, связанных с генетическими аномалиями. Не секрет, что сейчас зачастую животные разных видов и пород скрещиваются случайно – без определенных задач, стратегии, в результате чего потомство приобретает различные генетические аномалии. Поиск маркеров, которые с этим связаны, для предупреждения использования такого животного в селекции – также важная составляющая научной части.
Самое главное, что дает технология – это поддержание генетического разнообразия(рис. 8).
В этой технологии производится поиск и валидация полиморфизмов, которые и составляют ее основу.
Примеры из практики показывают, что на протяжении ближайших лет планируется постепенный уход от микросателлитного анализа и STR-маркеров к SNP, поскольку это дает больше информации. Если количество используемых маркеров STR исчисляется десятками (до 20 шт.), то SNP – сотнями, а при поиске родства можно использовать 500-800 маркеров SNP.
Примеры из практики показывают, что на протяжении ближайших лет планируется постепенный уход от микросателлитного анализа и STR-маркеров к SNP, поскольку это дает больше информации. Если количество используемых маркеров STR исчисляется десятками (до 20 шт.), то SNP – сотнями, а при поиске родства можно использовать 500-800 маркеров SNP.Кроме того, возможность комбинировать внутри одной технологии поиск разных признаков: родства, болезни, какие-то внешние особенности, чего принципиально не позволяют STR-маркеры. За технологией, основанной на однонуклеотидных полиморфизмах – будущее. Европа уже активно внедряет ее, и есть мнение, что в России она тоже будет постепенно будет внедряться, потому что это прогресс, новизна и повышение конкурентоспособности между разными учреждениями. Особенно в свете действия решения Евразийской экономической комиссии об утверждении списков маркеров, о котором сказано в первой части этого вебинара. Многие только сейчас начали внедрять STR после вступления этого приказа в силу, но уже сегодня ясно, что если посмотреть на год-другой в будущее, то лаборатории, которые внедряют таргетный NGS, будут конкурентоспособнее и будут предлагать больше востребованных услуг.
Приведенный слайд отображает полноту ресурсов, которые предоставляет в этих целях Thermo FS на всех этапах: подготовка образца, создание панелей по индивидуальному дизайну, подготовка библиотек, секвенирование, анализ данных.
Решения ThermoFisher Scientific по NGS в генотипировании собак и кошек
(рис. 9)
Базовые решения – это готовые панели AgriSeq, разработанные по рекомендациям ISAG.
Первая – Canine Traits and Disorders Panel, предполагающая диагностику заболеваний и различных признаков собак. Она содержит около 154 маркеров: 97 полиморфизмов и комплексные маркеры, такие как 13 инсерций, 38 делеций, 6 MNP – множественных нуклеотидных полиморфизмов. то есть серий смежных снипов. Это все тоже кодирует определенные признаки.
Эта панель создавалась так, чтобы охватить максимально все породы, то есть чтобы маркеры были общие. Но там есть и маркеры, специфичные только к определенным породам собак. Доступен файл *.xls с перечнем маркеров. Обычно такие панели содержат их нескольких сотен.
Для анализа используется новейший референтный геном CanFam 3.1.
Вторая панель – непосредственно от ISAG, Canine SMP Parentage and Identification, происхождение и идентификация.
Она содержит порядка 400 маркеров, в том числе 379 SNP и 2 делеции, и панель была валидирована с использованием образцов ISAG и ICAR.
Средняя доля обнаруженных генотипов составляет 99.2% - это очень высокий показатель работоспособности маркеров.
Эти панели разделены для удобства – происхождение отдельно, болезни отдельно, их можно запускать обе и можно сделать кастомную панель, взяв нужные маркеры с одной и другой и добавив пользовательские индивидуальные маркеры. Коллеги из группы Thermo FS по биоинформатике поддержат, расскажут, помогут разработать индивидуальный дизайн панели.
При этом, если поработав с индивидуально разработанной панелью, спустя какое-то время пользователь понимает, что ему нужно добавить туда какие-то новые маркеры, нет ничего проще: заявка оформляется письмом руководителю подразделения (Диане Дроботовой), в письме нужно указать, какие новые маркеры нужно добавить, предоставить полные описания по этим маркерам. В следующую партию панелей этого пользователя нужные маркеры будут добавлены, панель по индивидуальному дизайну придет к пользователю уже обновленной.
Панели по кошкам менее востребованы, но у Thermo FS есть общая панель происхождения, по болезням и признакам – около 110 маркеров, в том числе 64 – кодирующие определенные важные признаки и нарушения: 43 SNP, 1 MNP, 4 вставки, 16 делеций, маркеры идентификации. Все образцы были валидированы с использованием образцов ISAG и ICAR. Доля обнаруженных генотипов высока – почти 100%, если точнее – 99,3%.
Технология Axiom в разведении мелких домашних животных
При использовании микрочипов Axiom работает тот же принцип. Анализ многочисленных публикаций о том, что касается рынка использования этой технологии при работе с мелкими животными, дает следующие результаты.
- Медицинские исследования: в случаях, когда животных используют как модельные организмы для изучения заболеваний человека.
- Ветеринарные исследования: собственно работа с изучением болезней собак, выяснение, почему те или иные породы болеют, в чем причина таких генетических особенностей. Это можно рассматривать на уровне генома.
В обеих задачах используется генотипирование высокой плотности (GWAS, поиск вариации числа копий генов).
- Генетическое разнообразие пород: ДНК-паспортизация и подтверждение происхождения, оценка экстерьера для составления паспорта, собственно поддержание генетического разнообразия. Частные центры и лаборатории все чаще предлагают такие услуги. В этом случае нужна высокая пропускная способность, поэтому достаточно низкой плотности и применяется рутинное генотипирование. Так проверяется принадлежность к породе, проводится подтверждение отцовства. В такие исследования можно включать и STR маркеры.
Зачастую заводчики не используют такие современные подходы и скрещивание проводится по каким-то своим внешним признакам, но опять-таки для ассоциаций производителей, которые применяют наукоемкие технологии, геномную селекцию, можно говорить о совершенно новых породах и существенном улучшении существующих пород.
Все эти области применения можно покрывать с помощью ДНК-чипов высокой плотности.
Первое решение – это сразу два чипа (Array A & B), дающих максимальный охват маркеров – всего около миллиона. При создании этого комплекта чипов секвенировано более 300 пород собак, в числе которых лабрадоры, немецкие, бельгийские и голландские овчарки, бельгийские тервюрены, миниатюрные шнауцеры, золотистые ретриверы и лабрадоры-ретривкеры, вести (Вест Хайленд Уайт терьер), возможно. болонки. керн-терьеры, бордер-колли, леонбергеры. Тоо есть исследованы породы разных групп: спортивные, рабочие, декоративные. охотничьи. пастушьи, терьеры и другие.
В их контент включены следующие блоки:
- породоспецифичные маркеры для проведения идентификации;
- функциональные, межгенные варианты, маркеры определенных пород собак.
Thermo FS берет контент тех чипов, которые сейчас уже есть на рынке. прежде всего иллюминовский контент для максимального охвата. Таким образом, на сегодня эти два чипа дают максимальное количество маркеров, которое поможет на первичном скрининге.
Когда есть задача по изучению породы либо выведению собственных пород, в том числе пород с заданными характеристиками, на первом этапе производится полногеномный поиск ассоциаций – скрининг по максимальному количеству маркеров, после чего выбираются маркеры, представляющие интерес.
Чипы включают в числе прочих уникальные редко встречающиеся маркеры у редких пород собак, что важно, если речь идет о местных породах. На слайде перечислены породы, которые использовались в качестве объектов исследований. В Thermo FS прогенотипировали более 2 тыс. образцов, чтобы выбрать породоспецифичные маркеры, которые работают. Главное, чтобы они были максимально равномерно распределены по геному и максимально охватывали все локусы, которые представляют интерес.
Второй вид чипа – Canine HD Array – тоже высокой плотности, но там не миллион, а порядка 700 тысяч маркеров, чуть меньше. Он включает наиболее интересные маркеры из большого чипа и главным образом предназначен для распространенных пород. (рис. 10)
Если пользователь работает с условно стандартной распространенной породой, о которой много информации, именно этот чип будет идеальным решением. У него максимальная плотность, максимальный охват генома и максимальная вероятность встретить маркеры, специфичные к конкретной породе.
В этом случае тоже возможен индивидуальный дизайн, когда за основу берется готовый стандартный чип, к нему добавляются маркеры по выбору пользователя или удаляются существующие маркеры. Можно совмещать разные породы, разные маркеры, даже разные виды животных, что может быть интересно тем, кто работает с разными объектами исследования.
У этого предложения есть, по нашему мнению, большой потенциал в России, потому что заводчикам дорогих собак нужно иметь понимание, как исключить генетически больных животных из разведения, или выводить животных которые требуют (или не требуют) каких-то специфических кормов и иных условий. Есть потребность в изучении существующих пород.
Это интересное направление, так что в любом случае диагностика – AgriSeq, NGS – актуальна. Сейчас многие лаборатории отправляют образцы в Европу, где тоже представляют интересы заводчиков, и там пишут сайты для России и на русском языке, но вопрос к стоимости отправки: логистика не всегда хорошо работает, особенно в условиях распространения новой коронавирусной инфекции.
Потому Thermo FS предлагает рассмотреть генотипирование животных – хотя бы диагностику, родство, генетические заболевания – здесь, в России, на базе нескольких лабораторий, куда можно отправить образцы.
Есть еще один интересный продукт, не совсем совпадающий с тематикой вебинара, но являющийся важной составляющей технологии Axiom – изучение микробиома.
Мы говорим о методе, альтернативном 16S РНК – сканировании, микробиоидном профилировании. Для этого решения есть отдельная презентация, которую можно отправить в случае интереса пользователей по запросу. Есть данные о сравнении исследований, проведенных методами 16S РНК и микрочипов Axiom. Это может быть актуально, например, для нутригеномики, в том числе применительно к собакам – для исследования их реакции на определенные корма.
Ценовая политика решений Thermo FS в генотипировании
Что касается цен – их формируют дистрибьюторы, так что целесообразно указать хотя бы их диапазон – впрочем, все это очень сильно зависит от дизайна панели, особенно у AgriSeq. Например, панель от 1000 или чуть меньше маркеров имеет себестоимость от 18-20 до 40 долларов. Чем больше образцов, тем дешевле. Соответственно, чем больше маркеров и больше панель, тем дороже – и значит, дороже себестоимость образца. Так что количество образцов и маркеров находится в обратной зависимости.
Чипы дороже. Недавно производили расчет чипа для КРС недавно считали чип средней плотности – цена составляла минимум 20 долларов. То есть за 20 – 20 с небольшим долларов можно проводить генотипирование, но только для случая КРС, для других животных или растений это будет дороже. Цена зависит от многих факторов.
Дело в том, что чип нельзя делить. При использовании чипов высокой плотности нужно понимать, что придется прогенотипировать 96 образцов. Чтобы уменьшить это количество, придется либо изготовить кастомную панель, для которой есть формат 24 образца, или же обычную панель на 96 образцов можно дробить на несколько видов животных, если речь об использовании ее в институтах, когда каждая лаборатория копит свои пробы, но у нее их менее 96.
При использовании панели можно прогонять меньшее количество образцов, но нужно считать количество реагентов, потому что есть баркоды, которые требуются для меток образцов. Поскольку производится массовое NGS секвенирование образцов, минимальный формат 96 предусматривает 96 баркодов. Но можно меньше: пользователь открывает коробку, сегодня он запустил 96 образцов, завтра те же самые образцы с той же коробкой запустили Library Kit.
По AgriSeq рекомендуется считать индивидуально, потому что расчет себестоимости здесь сложнее, чем с Axiom, в этом случае больше разных составляющих, и это можно рассчитать по индивидуальному заказу.
Вопросы можно задать по телефону +7-916-361-78-36 или электронной почте diana.drobotova@thermofisher.com.
Ссылки на остальные части вебинара
Геномные технологии в программах селекции в животноводстве. Часть 1.
Геномные технологии в программах селекции в животноводстве. Часть 2.
