Набор diaGene для элюции ДНК из агарозного геля

Набор предназначен для элюции и очистки фрагментов ДНК из легкоплавкого агарозного геля после электрофоретического разделения. С помощью набора можно элюировать ДНК из ТАЕ- или ТВЕ-геля, процесс прост и занимает не более 15-20 минут. После отмывки от примесей чистый препарат ДНК элюируется с колонки.

Полученный препарат ДНК может использоваться для рестриктазного расщепления, лигирования, секвенирования и др.

Ёмкость колонки diaGene составляет до 25 мкг ДНК.

Буфер для сорбции М содержит в своем составе индикатор кислотности. Эффективность сорбции ДНК зависит от рН (связывание ДНК с сорбентом происходит при рН < 7,5). При оптимальном для сорбции рН индикатор имеет желтый цвет. Если после добавления к образцу

	50 выделений Кат.№ 3326.0050	250 выделений Кат.№ 3326.0250
Буфер М	35 мл	2 x 75 мл
Буфер W	8 мл	3 х 15 мл
Буфер Е	5 мл	25 мл
Микроколонки	50 шт.	5 x 50 шт.
2 мл пробирки для сбора фильтрата	50 шт.	5 x 50 шт.

Срок годности и особенности хранения:

• все реактивы и колонки хранить при комнатной температуре (+15...25 °С);
• после использования пакет с колонками рекомендуется плотно закрывать;
• срок годности: 12 месяцев с даты изготовления;
• при транспортировке особые условия не требуются.

Дополнительное оборудование и реагенты:

• твердотельный термостат, желательно с функцией перемешивания;
• микроцентрифуга для пробирок типа эппендорф ёмкостью 1,5-2 мл с максимальной скоростью центрифугирования не менее 13000 об/мин;
• дозаторы переменного объёма и наконечники с фильтрами к ним;
• стерильные пробирки типа эппендорф ёмкостью 1,5 мл, свободные от нуклеаз;
• 96% этанол;
• 3М раствор ацетата натрия рН 5,0;
• опционально — деионизованная автоклавированная вода или вода, свободная от нуклеаз.

Элюция ДНК из агарозного геля

Перед началом работы добавьте 96% этанол в Буфер W (32 мл для 50 выделений, 60 мл в каждый флакон для 250 выделений), тщательно перемешайте.

1. Вырежьте скальпелем фрагмент геля, содержащий необходимый фрагмент ДНК.
2. Взвесьте фрагмент геля в 1,5 мл пробирке и добавьте Буфер М из расчёта 300 мкл Буфера М на 100 мг геля.
3. Инкубируйте при 50 °С, периодически перемешивая, до полного растворения геля (не более 10 мин).
4. Поместите микроколонку в 2 мл пробирку для сбора фильтрата. Перенесите полученный раствор (но не более 650 мкл) в микроколонку и центрифугируйте 1 мин при 13000 об/мин. Если объем раствора превышает объем колонки (650 мкл), его можно наносить последовательно, удаляя всякий раз фильтрат.
5. Вылейте фильтрат, поместите микроколонку в ту же пробирку и нанесите 650 мкл Буфера W. Центрифугируйте 1 мин при 13000 об/мин.
6. Вылейте фильтрат, поместите микроколонку в ту же пробирку и центрифугируйте 1 мин при 13000 об/мин, чтобы удалить остатки Буфера W.
7. Поместите микроколонку в новую 1,5 мл пробирку. Нанесите в центр мембраны 30-50 мкл Буфера Е и подождите 1 мин. Элюируйте ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 13000 об/мин. Также для элюции можно использовать воду, свободную от нуклеаз. Минимальный объём элюции — 30 мкл.

Возможные проблемы и методы их решения

Проблема	Причина	Решение
Мало ДНК на выходе	рН раствора не оптимален для связывания ДНК с сорбентом	Обратить внимание на цвет индикатора. Если он отличается от желтого, добавить 10 мкл 3М ацетата Na (рН 5,0)
	Перед стадией элюции не полностью удалены остатки Буфера W	Обратить внимание на пункт o дополнительном центрифугировании
	Гель растворен не полностью	Инкубировать при 50 °C 10 минут, перемешивая каждые 2-3 минуты