Набор реактивов для обратной транкрипции с MMLV–RH представляет собой полную систему для эффективного синтеза первой цепи кДНК с использованием в качестве матрицы мРНК или суммарной РНК. Набор содержит все необходимые компоненты для проведения обратной транскрипции: обратную транскриптазу
MMLV–RH, два варианта 5× ОТ-буфера, смесь dNTP, раствор ДТТ, растворы олиго(dT)
16
праймера и случайного гексапраймера, а также свободную от РНКаз воду.
MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.
Кроме обратной транскриптазы, набор содержит два типа буфера на основе KCl и (NH4)2SO4, оптимизированные для проведения эффективной реакции обратной транскрипции с любых матриц РНК, в том числе содержащих участки повышенной сложности (сильно структурированные или GC-богатые).
Олиго(dT)16 праймер и случайный гексапраймер позволяют более узконаправленно подходить к обратной транскрипции интересующих типов или участков РНК. Случайный гексапраймер неспецифически связывается с РНК-матрицей и используется для синтеза кДНК со всех типов РНК в составе суммарной РНК. Олиго(dT)16
праймер селективно отжигается на полиадениновых последовательностях РНК, обеспечивая синтез кДНК только с мРНК, содержащих поли(А)-3’-конец. Также можно использовать специфичные праймеры для синтеза определённой последовательности.
Состав набора
|
Компонент
|
Кат. #
|
|
1967.0050
|
1959.0250
|
|
MMLV-RH ревертаза, 100 ед. акт./ мкл*
|
1 × 50 мкл (5000 ед.акт.)
|
2 × 250 мкл (25000 ед.акт.)
|
|
5× ОТ-буфер (KCl)
|
1 × 220 мкл
|
3 × 400 мкл
|
|
5× ОТ-буфер ((NH4)2SO4)
|
1 × 220 мкл
|
3 × 400 мкл
|
|
20× смесь dNTP (10 мМ каждого)
|
1 × 120 мкл
|
2 × 300 мкл
|
|
Дитиотреитол
|
1 × 110 мкл
|
2 × 260 мкл
|
|
Случайный гексапраймер, 20 мкМ
|
1 × 50 мкл
|
1 × 260 мкл
|
|
Олиго(dT) праймер, 20 мкМ
|
1 × 50 мкл
|
1 × 260 мкл
|
|
Вода, обработанная ДЭПК
|
3 × 600 мкл
|
5 × 1.8 мл
|
* За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при +37 °С.
Источник
Фермент получен из рекомбинантного штамма
Е. coli, содержащего делеционный вариант гена обратной транскриптазы MMLV.
Буфер для хранения:
50 мМ Трис-HCl, pH 8.0 (при +25°C), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50 % (v/v) глицерин и 0.1 % (v/v) NP-40.
5× ОТ-буфер (KCl):
250 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25°C), 250 мM KCl, 20 мМ MgCl
2, стабилизаторы.
5× ОТ-буфер ((NH4)2SO4):
250 мM Трис-НCl, рН 8.5 (при +25°C), 100 мM (NH
4)
2SO
4, 20 мМ MgCl
2, стабилизаторы.
Область применения:
- Синтез первой цепи кДНК для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
- Синтез кДНК для клонирования.
- Получение меченых кДНК-зондов для микрочипов (microarray).
- Мечение ДНК.
- Анализ РНК с помощью праймер-экстеншн.
Хранение и транспортировка:
при -20°С; не более 50 циклов замораживания-размораживания.
