Молекулярное клонирование, модификация нуклеиновых кислот

X-gal, известный как 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид, представляет собой хромогенный субстрат для фермента бета-галактозидазы. В процессе расщепления этого субстрата ферментом происходит отделение индольной структуры, которая затем окисляется и преобразуется в осадок синего цвета. Эта характеристика находит широкое применение в областях клеточной и молекулярной биологии.

Основное использование X-gal заключается в анализе активности гена-репортера lacZ, который кодирует бета-галактозидазу в клетках бактерий, дрожжей и животных. В растительных клетках для анализа активности используется репортерный ген GUS, с X-gal в качестве маркера активности.

Кроме того, X-gal применяется в сочетании с гликозидазными конъюгатами в качестве реагента для вторичного обнаружения в методиках иммуногистохимии и ELISA.

Благодаря тому, что бета-галактозидаза остается активной в фиксированных клетках и тканях, X-gal эффективно используется для детекции её активности.

X-gal, или 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид — хромогенный субстрат для фермента бета-галактозидазы. При расщеплении бета-галактозидазой от субстрата отщепляется индольная структура, которая спонтанно окисляется и выпадает в виде осадка синего цвета. Это свойство широко используется в молекулярной и клеточной биологии.

В первую очередь, X-gal применяется для анализа активности репортерного гена lacZ, кодирующего бета-галактозидазу, в клетках бактерий, дрожжей и животных. В растениях в качестве репортерного гена, маркером активности которого также является X-gal, используется ген GUS.

Также X-gal используется совместно с конъюгатами гликозидаз в качестве реагента для вторичной детекции при иммуногистохимии и ELISA.

Наконец, поскольку бета-галактозидаза сохраняет свою активность в фиксированных клетках и тканях, X-gal используется для детекции её активности.

Деионизованная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) и отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для экспериментов с использованием РНК.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Не предназначена для ПЦР и экспериментов in vivo.

Деионизованная вода, отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для молекулярной биологии.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

ДНКаза I - эндонуклеаза, расщепляющая одно- и двухцепочечную ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов и монодезоксинуклеотидов с 5’-фосфатом и 3’-OH.

Так как фермент рекомбинантный, его раствор не содержит РНКаз.

Активность ДНКазы I зависит от присутствия ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, а также Mn²⁺. В присутствии Mg²⁺ фермент расщепляет каждую цепь двухцепочечной ДНК независимо друг от друга, случайным образом. В присутствии Mn²⁺ расщепление обеих цепей двухцепочечной ДНК происходит приблизительно в одном и том же месте, при этом концы фрагментов ДНК - тупые или выступающие на 1-2 нуклеотида.

Применение:

• Получение препаратов РНК, не содержащих примеси ДНК;
• расщепление матрицы ДНК после транскрипции in vitro;
• обратная транскрипция;
• мечение ДНК методом ник-трансляции (с использованием ДНК-полимеразы I);
• изучение взаимодействий «ДНК-белок» методом футпринтинга;
• получение библиотек вставок ДНК, перекрывающихся случайным образом.

Фермент комплектуется двумя 10-кратными реакционными буферами - с MgCl₂ и без MnCl₂

Важно! ДНКаза I чувствительна к физической денатурации - не перемешивать на вортексе или пипетированием. Перемешивать только переворачиванием пробирки.

Условия хранения: -20^оС

Ингибитор RiboLock ингибирует активность РНКаз А, В и С по неконкурентному механизму в соотношении 1 : 1. Не ингибирует эукариотические РНКазы T1, T2, U1, U2, CL3 и прокариотические РНКазы H и I.

Работает в большинстве реакционных смесей и защищает РНК от деградации при температурах до +55^оС.

Рекомендуемая рабочая концентрация - 1 ед/мкл.

В состав буфера для хранения входит ДТТ, который обеспечивает стабильность ингибитора, но не является необходимым компонентом реакционной смеси.

Области применения:

• Предохранение РНК от деградации при транскрипции и трансляции in vitro, обратной транскрипции, амплификации РНК, выделении мРНК-протеинового комплекса из клеток млекопитающих;
• выделение и хранение РНК;
• исследование специфической РНКазной активности.

Условия хранения: -20^оС

ИПТГ (Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) - высокостабильный аналог лактозы. Он инактивирует lac-репрессор и индуцирует синтез бета-галактозидазы, фермента, метаболизирующего лактозу. Используется как индуктор экспрессии генов, клонированных под контроль lac-оперона.

Также используется совместно с X-Gal для бело-голубой селекции клонов.

Рекомендуется приготовление стокового раствора в концентрации 100 мМ. Для бело-голубой селекции используется конечная концентрация 0.1 мМ.

Условия хранения: +4^оС

Водный раствор хлорида магния, отфильтрованный через мембрану 0.22 мкм. Предназначен для оптимизации условий ПЦР. Совместим со всеми полимеразами Thermo Scientific -Taq, DreamTaq, Phusion и др. Также может использоваться в качестве ко-фактора в других ферментативных реакциях.

Не содержит эндо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Условия хранения: -20^оС

Набор Mut Express II V2 является передовым инструментом для точного мутагенеза, который использует принципы гомологичной рекомбинации. Этот комплект включает в себя высокоточную систему ДНК-полимеразы для амплификации и инновационную систему быстрого клонирования. Особенностью полимеразы является её способность минимизировать вероятность возникновения нецелевых мутаций в процессе амплификации, что делает её идеальной для работы с плазмидами до 20 тысяч пар оснований. Система ClonExpress, в свою очередь, заменяет стандартные методы отжига и циклизации на более продуктивный процесс гомологичной рекомбинации. Это обеспечивает более гибкую подготовку праймеров и снижает потребность в исходном материале, способствуя эффективному устранению матрицы с метилированием. Улучшенные реакционные буферы и рекомбиназа повышают общую эффективность и устойчивость к загрязнениям, позволяя использовать продукты амплификации непосредственно в рекомбинационных реакциях без дополнительной очистки.

• Используемая ДНК-полимераза сводит к минимуму возникновение вторичных мутаций;
• амплифицированный продукт можно непосредственно использовать в реакции рекомбинации;
• подходит для амплификации любого участка, размером до 20 т.п.н.

Условия хранения: от -30 до -15 °C.

Условия транспортировки: ≤0 °C.

Состав набора:

Набор Mut Express MultiS V2 представляет собой комплект для мутагенеза, который использует принципы ClonExpress для эффективного внесения изменений в ДНК. Этот набор позволяет одновременно модифицировать до пяти различных участков на целевой плазмиде, что делает его мощным инструментом для генной инженерии. Включенная система ДНК-полимеразы обладает высокой точностью, что снижает риск возникновения нежелательных мутаций во время амплификации. Это особенно ценно при работе с большими плазмидами, размер которых может достигать 20 тысяч пар оснований.

Система быстрого клонирования ClonExpress заменяет традиционные методы, такие как отжиг и циклизация, на более эффективный процесс гомологичной рекомбинации. Это обеспечивает более гибкую подготовку праймеров и минимизирует потребность в исходном материале, что способствует удалению метилированных матриц. Высокооптимизированный буфер и специально разработанная рекомбиназа Exnase MultiS увеличивают эффективность реакций и устойчивость к загрязнениям. Благодаря этому, продукты амплификации, которые прошли специфическое расщепление ферментом Dpn I, могут быть использованы непосредственно в рекомбинационных реакциях без предварительной очистки. Mut Express MultiS V2 является предпочтительным выбором для исследователей, стремящихся к выявлению множественных точечных мутаций в ДНК с высокой точностью и эффективностью.

• Используемая ДНК-полимераза сводит к минимуму возникновение вторичных мутаций;
• амплифицированный продукт можно непосредственно использовать в реакции рекомбинации;
• подходит для амплификации любого участка, размером до 20 т.п.н.

Условия хранения: от -30 до -15 °C.

Условия транспортировки: ≤0 °C.

Избегайте повторного замораживания и оттаивания!

Состав набора:

Набор для клонирования TA/Blunt-Zero представляет собой усовершенствованную систему TOPO клонирования, в которой используется новое поколение топоизомеразы. Этот фермент, работающий в синергии с оптимизированным буфером, обеспечивает повышенную активность, что способствует улучшению процесса клонирования. Процедура лигирования происходит быстро и эффективно, всего за 5 минут при комнатной температуре.

Инновационный вектор содержит ген ccdB, который служит маркером для отбора: в случае успешного введения вставки, экспрессия этого гена блокируется, позволяя клетке-хозяину выживать. Если же клонирование не происходит, клетка погибает, обеспечивая таким образом минимальный уровень фоновых колоний. Благодаря включению фактора притупления, данный комплект совместим как с ТА-клонированием, так и с клонированием, использующим векторы с тупыми концами, что делает его универсальным инструментом для молекулярной биологии. Процесс клонирования занимает всего 5 минут; эффективность: выше 95 % положительных результатов.

Условия хранения: от -30 до -15 °C.

Условия транспортировки: ≤0 °C.

Состав набора:

ClonExpress II One Step — это набор для клонирования любого фрагмента в любой сайт любого вектора, не содержит Т4 ДНК лигазу. В наборе используется метод гомологичной рекомбинации, снижающий вероятность самолигирования вектора, метод устраняет необходимость подбора сайтов гидролиза эндонуклеазами рестрикции, процент положительных клонов более 95%.

На 1 этапе вектор нужно линеаризовать, например, путем расщепления эндонуклеазами рестрикции или другим способом, добавить к концам клонируемого фрагмента последовательности длиной от 15 до 20 п. н. комплиментарные 5'- и 3'-концам полученного вектора используя ПЦР. Далее клонируемый фрагмент и линеаризованный вектор смешать в определенных пропорциях и инкубировать с ExnaseII 30 минут при 37 °C.

В состав набора ClonExpress II One Step входит Exnase II и буфер, повышающие эффективность рекомбинации. Exnase II устойчива к ингибиторам, так что, линеаризованный вектор, и клонируемый фрагмент, могут быть непосредственно использованы для клонирования без дополнительной очистки из реакционных смесей.

Преимущества набора ClonExpress II One Step

• Простое, быстрое, эффективное клонирование любого фрагмента;
• направленное клонирование по любому сайту в любой вектор;
• не нужно учитывать сайты рестрикции, содержащиеся в клонируемом фрагменте;
• размеры фрагментов ДНК с эффективным клонированием — от 50 п.н. до 10 тыс. п.н.;
• возможность клонирования без очистки линеаризованного векторов и ПЦР-продуктов;
• не содержит лигазы;
• положительные результаты, % — более 95.

Комплект поставки: Буфер CE II (5х), Exnase II, контрольная вставка 500 bp (20 нг/мкл), линеаризованный контрольный вектор pUC19 (50 нг/мкл).

Условия хранения: -20 °С.

ClonExpress MultiS — это усовершенствованная версия, предназначенная для многофрагментной рекомбинации, что позволяет одновременно клонировать до пяти различных фрагментов ДНК.

Технология ClonExpress представляет собой инновационный метод клонирования, который позволяет вставлять последовательности в любое место вектора без необходимости использования лигаз. Метод обеспечивает совпадение 5'- и 3'-концов амплифицированного продукта с концами линеаризованного вектора. Смешивание продукта ПЦР с вектором и последующая рекомбинация под действием рекомбиназы приводят к формированию клонированной ДНК.

Использование данного набора гарантирует высокие результаты без использования лигаз, с отсутствием самолигирования, а также демонстрирует более 95% положительных результатов.

С помощью данного набора Вы сможете эффективно клонировать фрагменты ДНК длиной от 50 до 10 т.п.н. (применимо для 2-5 фрагментов).

Условия хранения: от -30 до -15 °C.

Условия транспортировки: ≤0°C.

Избегайте повторного замораживания и оттаивания!

Состав набора:

Набор для клонирования ClonExpress Ultra One Step предназначен для рекомбинантного клонирования, совместимых с гомологичной рекомбинацией от 1 до 5 фрагментов. Процесс клонирования происходит без использования лигаз, благодаря чему уменьшается вероятность самолигирования. В набор входит улучшенная рекомбиназа Exnase, повышающая эффективность рекомбинации и устойчивость к примесям. Компоненты набора позволяют работать с большинством продуктов ПЦР, благодаря высокой совместимости, что, в свою очередь, позволяет использовать продукты ПЦР непосредственно для рекомбинации без какой-либо обработки. Все эти характеристики позволяют упростить процесс клонирования и минимизировать риски ошибок.

• Супермикс уже готовый к использованию;
• процесс рекомбинации занимает от 5 до 15 минут;
• возможность клонирования фрагментов от 50 п.н. до 10 т.п.н., имея выше 95% положительных результатов.

Условия хранения: от -30 до -15 °C.

Условия транспортировки: ≤0 °C.

Состав набора:

ClonExpress представляет собой инновационный метод бесшовного клонирования, который упрощает процесс внедрения ДНК-фрагментов в любую позицию вектора. Эта технология выделяется своей простотой и скоростью, обеспечивая высокую эффективность клонирования.

ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2 является продвинутым решением для рекомбинантного клонирования, поддерживающим одновременную рекомбинацию от одного до пяти фрагментов. Специально разработанная смесь 2×CE усиливает процесс рекомбинации, что особенно важно при работе с множественными фрагментами. Продукт также характеризуется повышенной совместимостью с GC-богатыми гомологичными участками, что расширяет его применимость даже в сложных экспериментальных условиях.

• Супермикс предоставляется в форме, немедленно готовой к применению;
• процесс может быть завершён за 5–30 минут;
• аозможно клонирование фрагментов длиной от 50 п.н. до 10 т.п.н. с вероятностью успеха более 95%;
• эффективно работает с GC- и AT-богатыми участками;
• поддерживает перекрытие длиной от 15 до 35 п.н., обеспечивая большую гибкость в выборе участков для клонирования.

Условия хранения: от -30 до -15 °C.

Условия транспортировки: ≤0 °C.

Состав набора:

Набор для клонирования ПЦР-продуктов FastCLone представляет собой усовершенствованную систему положительной селекции для высокоэффективного клонирования ПЦР-продуктов, полученных с помощью любой термостабильной ДНК-полимеразы. С помощью набора FastCLone может быть клонирован любой ДНК-фрагмент имеющий как тупые так и липкие концы. FastCLone идеально подходит для клонирования фосфорилированных или нефосфорилированных фрагментов ДНК. В комплект набора входит вектор содержащий летальный ген, который разрушается лигированием вставки ДНК в сайт клонирования. В результате только бактериальные клетки содержащие рекомбинантные плазмиды способны образовывать колонии. Такой положительный отбор ускоряет процесс скрининга колоний и устраняет дополнительные затраты, необходимые для проведения бело-голубой селекции.

Применение набора для клонирования ПЦР-продуктов FastCLone:

• клонирование ПЦР-продуктов с тупыми или липкими концами;
• клонирование фрагментов ДНК, полученных после гидролиза эндонуклеазами рестрикции;
• транскрипция in vitro и in vivo клонированных вставок промотора Т7.

Условия хранения: -20 °С.

Современные ДНК-лигазы одинаково быстро и эффективно сшивают как липкие, так и тупые концы. Одна из таких разновидностей лигаз используется в готовых наборах для клонирования CloneJET PCR, Thermo Fisher Scientific.

Наборы CloneJET PCR – это оптимизированные системы с позитивной селекцией для эффективного клонирования ПЦР-продуктов, синтезированных любыми термостабильными ДНК-полимеразами. С помощью наборов CloneJET PCR можно клонировать ДНК-фрагменты с любыми концами – тупыми или липкими, фосфорилированными или не фосфорилированным. Лигирование занимает всего 5 минут, а выход рекомбинантных клонов составляет более 99% благодаря использованию вектора pJET1.2/blunt с позитивной системой селекции.

Примеры применения:

• клонирование продуктов ПЦР с тупым или 3'-dA-концом длиной до 10 кб;
• клонирование фрагментов ДНК, генерируемых рестрикционными ферментами;
• секвенирование клонированной ДНК;
• транскрипция in vitro и in vivo клонированных вставок из промотора T7.

Клонирование с использованием наборов CloneJET PCR включает в себя этап достройки липких концов, получающихся при использовании для ПЦР стандартной Taq-полимеразы или при рестриктазном расщеплении ДНК. При этом реакция лигирования тупоконечной вставки длиной до 3000 пар нуклеотидов с линейным вектором занимает всего 5 минут (при более длинных вставках время лигирования увеличивается). Позитивная селекция клонов со вставкой осуществляется за счёт встраивания клонируемого фрагмента в последовательность летального гена eco47IR, тем самым выключая этот ген и обеспечивая жизнеспособность рекомбинантных клонов.

Преимущества наборов CloneJET PCR:

• универсальный вариант для клонирования фрагментов с тупым или липким концами;
• быстрое клонирование ПЦР-фрагмента всего за 5 минут;
• эффективность – более 99% положительных клонов;
• отсутствие фоновых клонов с «пустым» вектором.

Стартовый комплект реагентов и рестриктаз Anza 10-pk включает в себя 5 эндонуклеаз рестрикции, 2 модифицирующих ДНК фермента и буферы.

Состав набора:

• Anza 11 EcoRI;
• Anza 5 BamHI;
• Anza 1 NotI;
• Anza 16 HindIII;
• Anza 12 XbaI;
• Anza 8 XhoI;
• Anza 3 BcuI (isoschizomer to SpeI);
• Anza 10 DpnI;
• Anza 19 BglII;
• Anza 26 Eco32I (isoschizomer to EcoRV);
• Anza T4 DNA Ligase Master Mix;
• Anza Alkaline Phosphatase;
• Anza Buffer (10X);
• Anza Red Buffer (10X).

Эндонуклеазы рестрикции, ДНК-модифицирующие ферменты и наборы ферментов для клонирования ДНК Anza, Thermo Fisher Scientific — это современные технологии, которые помогают экономить время и реагенты при постановке генно-инженерных экспериментов. Продукция Anza — это линейка ферментов, позволяющая исследователю использовать: 128 рестриктаз; 5 ДНК-модифицирующих ферментов. При клонировании с помощью ферментов Anza используется общий протокол для расщепления ДНК любыми рестриктазами Anza, а также единый буфер для рестриктаз и ДНК-модифицирующих ферментов. Такой подход устраняет необходимость в последовательных инкубациях и промежуточных очистках ДНК, необходимых при смене буферов, что позволяет существенно экономить время и снизить потери образца. Преимущества наборов ферментов для клонирования Anza (в состав наборов включены 5 или 10 наиболее часто используемых рестриктаз, ДНК-лигаза, щелочная фосфатаза и универсальный буфер): удобно: все ферменты Anza полноценно работают в универсальном буфере Anza; быстро: 15-минутный протокол обработки ДНК; просто: не требуются сложные и длительные этапы промежуточной очистки продуктов реакции; надежно: отсутствие "звездной" активности; полная система: в набор входят все необходимые модифицирующие ферменты ДНК Anza для полноценного клонирования.

Стартовый комплект реагентов и рестриктаз Anza 5-pk включает в себя 5 эндонуклеаз рестрикции, 2 модифицирующих ДНК фермента и буферы.

Состав набора:

• Anza 11 EcoRI;
• Anza 5 BamHI;
• Anza 1 NotI;
• Anza 16 HindIII;
• Anza 12 XbaI;
• Anza T4 DNA Ligase Master Mix;
• Anza Alkaline Phosphatase;
• Anza Buffer (10X);
• Anza Red Buffer (10X).

Эндонуклеазы рестрикции, ДНК-модифицирующие ферменты и наборы ферментов для клонирования ДНК Anza, Thermo Fisher Scientific — это современные технологии, которые помогают экономить время и реагенты при постановке генно-инженерных экспериментов. Продукция Anza — это линейка ферментов, позволяющая исследователю использовать: 128 рестриктаз; 5 ДНК-модифицирующих ферментов. При клонировании с помощью ферментов Anza используется общий протокол для расщепления ДНК любыми рестриктазами Anza, а также единый буфер для рестриктаз и ДНК-модифицирующих ферментов. Такой подход устраняет необходимость в последовательных инкубациях и промежуточных очистках ДНК, необходимых при смене буферов, что позволяет существенно экономить время и снизить потери образца. Преимущества наборов ферментов для клонирования Anza (в состав наборов включены 5 или 10 наиболее часто используемых рестриктаз, ДНК-лигаза, щелочная фосфатаза и универсальный буфер): удобно: все ферменты Anza полноценно работают в универсальном буфере Anza; быстро: 15-минутный протокол обработки ДНК; просто: не требуются сложные и длительные этапы промежуточной очистки продуктов реакции; надежно: отсутствие "звездной" активности; полная система: в набор входят все необходимые модифицирующие ферменты ДНК Anza для полноценного клонирования.

РНКаза А - эндорибонуклеаза, расщепляющая одноцепочечную РНК по цитозиновым и урациловым остаткам. Так как РНКаза А от Thermo Scientific не содержит ДНКаз, не требуется её термическая обработка перед использованием.

Области применения:

• Выделение плазмидной и геномной ДНК;
• удаление РНК из препаратов рекомбинантных белков;
• исследования защищённости от РНКаз (совместно с РНКазой Т);
• картирование 1-нуклеотидных мутаций в ДНК и РНК.

Рекомендуемая рабочая концентрация РНКазы А - от 1 до 100 мкг/мл. В присутствии NaCl в низких концетрациях (до 100 мМ) РНКаза А расщпляет 1- и 2-цепочечную РНК, а также цепь РНК в составе гибридов ДНК-РНК. В присутствии NaCl в концентрации 0.3М и выше РНКаза А расщепляет только 1-цепочечную РНК.

Условия хранения: -20^оС

Смесь для лигирования 5min Universal Ligation Mix — это высокоэффективный микс, предназначенный для быстрого и удобного лигирования ДНК. Этот продукт содержит фермент ДНК-лигазу Т4, который способствует формированию стабильных фосфодиэфирных связей между 5'-фосфатными и 3'-гидроксильными концами в ДНК. Оптимизированный состав буфера усиливает процесс лигирования, делая его более эффективным.

Преимущества использования 5min Universal Ligation Mix

Быстрота действия: лигирование происходит всего за 5 минут при температуре 25 °C.

Удобство применения: реакционная смесь готова к использованию и может быть непосредственно применена для трансформации широкого спектра химически компетентных бактериальных клеток.

Этот продукт идеально подходит для исследователей, которым необходимо быстро и эффективно соединять ДНК-фрагменты, а также для тех, кто работает с большим количеством образцов и ценит время и удобство в лабораторных процедурах.

Условия хранения: от -30 до -15 °C.

Условия транспортировки: ≤0 °C.

Состав набора: