Молекулярное клонирование, модификация нуклеиновых кислот

X-gal, или 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид — хромогенный субстрат для фермента бета-галактозидазы. При расщеплении бета-галактозидазой от субстрата отщепляется индольная структура, которая спонтанно окисляется и выпадает в виде осадка синего цвета. Это свойство широко используется в молекулярной и клеточной биологии.

В первую очередь, X-gal применяется для анализа активности репортерного гена lacZ, кодирующего бета-галактозидазу, в клетках бактерий, дрожжей и животных. В растениях в качестве репортерного гена, маркером активности которого также является X-gal, используется ген GUS.

Также X-gal используется совместно с конъюгатами гликозидаз в качестве реагента для вторичной детекции при иммуногистохимии и ELISA.

Наконец, поскольку бета-галактозидаза сохраняет свою активность в фиксированных клетках и тканях, X-gal используется для детекции её активности.

Бензонуклеаза — это нуклеаза, расщепляющая все формы как ДНК, так и РНК (одноцепочечные, двухцепочечные, линейные и кольцевые). Фермент эффективен в широком диапазоне рабочих условий. Оптимальное значение pH для активности фермента составляет от 8,0 до 9,2. Бензонуклеаза гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов с концевыми 5’-монофосфатами длиной 3-5 оснований.

Применение:

Бензонуклеаза идеальна для широкого спектра применений, где желательно полное расщепление нуклеиновых кислот:

• для гидролиза природных или денатурированных нагреванием ДНК и РНК;
• для удаления нуклеиновых кислот во время экстракции белка: бензонуклеаза уменьшает вязкость образца и облегчает последующие операции по очистке рекомбинантного белка или экстракции белка из образцов клеток тканей;
• для удаления нуклеиновой кислоты из клеточного или бактериального лизата, снижения вязкости раствора и увеличения выхода белка;
• для удаления примесей нуклеиновых кислот из препаратов рекомбинантного белка для подготовки образцов для двумерного гель-электрофореза белков;
• для предотвращения слипания клеток в клеточной смеси;
• для расщепление нуклеиновых кислот для облегчения получения высококачественных телец включения перед ренатурацией нерастворимых белков;
• для удаления загрязнения ДНК при приготовлении проб вакцины и вируса.

Единица активности.

За единицу активности бензонуклеазы принимают количество фермента, превращающего 50 мкг ДНК спермы лосося в нуклеотиды за 30 минут при 37 °C в реакционном буфере: 50 мМ Трис-HСl, pH 8,0 и 1 мМ MgCl₂.

CAS No	9025-65-4
Чистота	≥ 90% (SDS-PAGE)
Концентрация	250 ед./мкл
Молекулярный вес (кДа)	30 000
Источник	Рекомбинантный белок полученный из E. coli
Оптимальная реакционная температура	20 - 37 °С
Оптимальный реакционный буфер	50 мМ Трис-HСl, 1 мМ MgCl₂, 50 - 150 мМ NaCl, pH 8,0
Токсичность	атоксичный
Условия хранения	50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂ и 50% глицерин
Температура хранения	-20 °C

Бензонуклеаза — это нуклеаза, расщепляющая все формы как ДНК, так и РНК (одноцепочечные, двухцепочечные, линейные и кольцевые). Фермент эффективен в широком диапазоне рабочих условий. Оптимальное значение pH для активности фермента составляет от 8,0 до 9,2. Бензонуклеаза гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов с концевыми 5’-монофосфатами длиной 3-5 оснований.

Применение:

Бензонуклеаза идеальна для широкого спектра применений, где желательно полное расщепление нуклеиновых кислот:

• для гидролиза природных или денатурированных нагреванием ДНК и РНК;
• для удаления нуклеиновых кислот во время экстракции белка: бензонуклеаза уменьшает вязкость образца и облегчает последующие операции по очистке рекомбинантного белка или экстракции белка из образцов клеток тканей;
• для удаления нуклеиновой кислоты из клеточного или бактериального лизата, снижения вязкости раствора и увеличения выхода белка;
• для удаления примесей нуклеиновых кислот из препаратов рекомбинантного белка для подготовки образцов для двумерного гель-электрофореза белков;
• для предотвращения слипания клеток в клеточной смеси;
• для расщепление нуклеиновых кислот для облегчения получения высококачественных телец включения перед ренатурацией нерастворимых белков;
• для удаления загрязнения ДНК при приготовлении проб вакцины и вируса.

Единица активности.

За единицу активности бензонуклеазы принимают количество фермента, превращающего 50 мкг ДНК спермы лосося в нуклеотиды за 30 минут при 37 °C в реакционном буфере: 50 мМ Трис-HСl, pH 8,0 и 1 мМ MgCl₂.

CAS No	9025-65-4
Чистота	≥ 99% (SDS-PAGE)
Концентрация	250 ед./мкл
Молекулярный вес (кДа)	30 000
Источник	Рекомбинантный белок полученный из E. coli
Оптимальная реакционная температура	20 - 37 °С
Оптимальный реакционный буфер	50 мМ Трис-HСl, 1 мМ MgCl₂, 50 - 150 мМ NaCl, pH 8,0
Токсичность	атоксичный
Условия хранения	50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂ и 50% глицерин
Температура хранения	-20 °C

Эндонуклеазы рестрикции от New England Biolabs комплектуются буфером, обеспечивающим максимальную активность конкретного фермента. Буфер NEBbuffer 1.1 (жёлтая маркировка) — один из четырёх стандартных рестриктазных буферов.

Состав 1-кратного буфера:

• 10 мМ MgCl₂;
• 10 мМ Бис-Трис-Пропан-HCl;
• 100 мкг/мл БСА;
• pH 7 (+25 °C).

Условия хранения — -20 ^°С.

Эндонуклеазы рестрикции от New England Biolabs комплектуются буфером, обеспечивающим максимальную активность конкретного фермента. Буфер NEBbuffer 2 (синяя маркировка) — один из четырёх стандартных рестриктазных буферов. В отличие от буфера NEBuffer 2.1, этот буфер не содержит БСА, поэтому рекомендуется использовать его с рестриктазами, не требующими БСА для своей работы.

Условия хранения — -20 ^°С.

Эндонуклеазы рестрикции от New England Biolabs комплектуются буфером, обеспечивающим максимальную активность конкретного фермента. Буфер NEBbuffer 2.1 (синяя маркировка) — один из четырёх стандартных рестриктазных буферов.

Состав 1-кратного буфера:

• 50 мМ NaCl;
• 10 мМ MgCl₂;
• 10 мМ Трис-HCl;
• 100 мкг/мл БСА;
• pH 7 (+25 °C).

Условия хранения — -20 ^°С.

Эндонуклеазы рестрикции New England Biolabs комплектуются буфером, обеспечивающим максимальную активность конкретного фермента. Буфер NEBbuffer 3 (красная маркировка) — один из четырёх стандартных рестриктазных буферов. В отличие от буфера NEBuffer 3.1, этот буфер не содержит БСА, поэтому рекомендуется использовать tuj с рестриктазами, не требующими БСА для своей работы.

Состав 1-кратного буфера:

• 10 мМ MgCl₂;
• 50 мМ Трис-HCl;
• 100 мМ NaCl;
• 1 мМ ДТТ;
• pH 7,9 (+25 °C).

Условия хранения — -20 °С.

Эндонуклеазы рестрикции от New England Biolabs комплектуются буфером, обеспечивающим максимальную активность конкретного фермента. Буфер NEBbuffer 3.1 (красная маркировка) — один из четырёх стандартных рестриктазных буферов.

Состав 1-кратного буфера:

• 10 мМ MgCl₂;
• 50 мМ Трис-HCl;
• 100 мМ NaCl;
• 100 мкг/мл БСА;
• pH 7,9 (+25 °C).

Условия хранения — -20 ^°С.

Эндонуклеазы рестрикции New England Biolabs комплектуются буфером, обеспечивающим максимальную активность конкретного фермента. Буфер NEBbuffer 4 (зелёная маркировка) — один из четырёх стандартных рестриктазных буферов. Этот буфер не содержит БСА, поэтому рекомендуется использовать его с рестриктазами, не требующими БСА для своей работы.

Состав 1-кратного буфера:

• 10 мМ MgCl_₂;
• 50 мМ ацетат калия;
• 20 мМ Трис-ацетат;
• 1 мМ ДТТ;
• pH 7,9 (+25 °C).

Условия хранения — -20 ^°С.

Эндонуклеазы рестрикции от New England Biolabs комплектуются буфером, обеспечивающим максимальную активность конкретного фермента. Буфер NEBbuffer 1 (жёлтая маркировка) — один из четырёх стандартных рестриктазных буферов. В отличие от буфера NEBuffer 1.1, этот буфер не содержит БСА, поэтому рекомендуется использовать его с рестриктазами, не требующими БСА для своей работы.

Состав 1-кратного буфера:

• 10 мМ MgCl₂;
• 1 мМ ДТТ;
• 10 мМ Бис-Трис-Пропан-HCl;
• pH 7,9 (+25 °C).

Условия хранения — -20 ^°С.

Деионизованная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) и отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для экспериментов с использованием РНК.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Не предназначена для ПЦР и экспериментов in vivo.

Деионизованная вода, отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для молекулярной биологии.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

ДНК-лигаза Т4 катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5’-фосфорилированным и 3’-гидроксилированным концами двух фрагментов двойной цепи ДНК или РНК. Фермент восстанавливает однонитевые разрывы в двойных цепях ДНК, РНК или гибридов ДНК/РНК. ДНК-лигаза сшивает как липкие, так и тупые концы, но не однонитевые нуклеиновые кислоты.

В качестве кофермента требуется наличие АТФ.

ДНК-лигаза Т4 от Thermo Scientific активна в рестриктазных буферах, лигазном буфере и буфере для обратной транскрипции.

Реакция лигирования липких концов происходит в течение 10 минут при комнатной температуре.

Для лигирования тупых концов в комплект входит раствор полиэтиленгликоля.

Области применения:

• Клонирование фрагментов ДНК или ПЦР-фрагментов в вектор после рестрикции;
• пришивка олигонуклеотидных линкеров и адапторов к ДНК;
• лигазная детекция РНК ;
• репарация 1-цепочечных разрывов в двухцепочечных молекулах нуклеиновых кислот;
• циркуляризация линейной ДНК.

ДНК-лигаза Т4 Thermo Scientific комплекутется 10-кратным лигазным буфером и 50% растворов ПЭГ.

Активность ДНК-лигазы может измеряться в единицах лигирования липких концов (лигирование 50% HindIII-фрагментов ДНК фага в течение 30 минут) или в единицах Вейсса (каталитическое превращение 1 нмоль дифосфата в течение 20 минут). 1 единица Вейса равна 200 единицам лигирования липких концов.

Важно!

1) Связывание лигазы с ДНК може приводить к смещению полос в агарозном геле. Во избежание подобного смещения рекомендуется добавлять к электрофорезным образцам буфер для нанесения с SDS и инкубировать образцы в течение 10 минут при +65^оС, а затем охладить во льду.

2) При электротрансформации лигазной смеси необходимо произвести очистку ДНК от фермента (на спин-колонках или фенол-хлороформной экстракцией)

Условия хранения: -20^оС

ДНК-лигаза Т4 катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5’-фосфорилированным и 3’-гидроксилированным концами двух фрагментов двойной цепи ДНК или РНК. Фермент восстанавливает однонитевые разрывы в двойных цепях ДНК, РНК или гибридов ДНК/РНК. ДНК-лигаза сшивает как липкие, так и тупые концы, но не однонитевые нуклеиновые кислоты.

В качестве кофермента требуется наличие АТФ.

ДНК-лигаза Т4 от Thermo Scientific активна в рестриктазных буферах, лигазном буфере и буфере для обратной транскрипции.

Реакция лигирования липких концов происходит в течение 10 минут при комнатной температуре.

Для лигирования тупых концов в комплект входит раствор полиэтиленгликоля.

Области применения:

• Клонирование фрагментов ДНК или ПЦР-фрагментов в вектор после рестрикции;
• пришивка олигонуклеотидных линкеров и адапторов к ДНК;
• лигазная детекция РНК ;
• репарация 1-цепочечных разрывов в двухцепочечных молекулах нуклеиновых кислот;
• циркуляризация линейной ДНК.

ДНК-лигаза Т4 Thermo Scientific комплекутется 10-кратным лигазным буфером и 50% растворов ПЭГ.

Активность ДНК-лигазы может измеряться в единицах лигирования липких концов (лигирование 50% HindIII-фрагментов ДНК фага в течение 30 минут) или в единицах Вейсса (каталитическое превращение 1 нмоль дифосфата в течение 20 минут). 1 единица Вейса равна 200 единицам лигирования липких концов.

Важно!

1) Связывание лигазы с ДНК може приводить к смещению полос в агарозном геле. Во избежание подобного смещения рекомендуется добавлять к электрофорезным образцам буфер для нанесения с SDS и инкубировать образцы в течение 10 минут при +65^оС, а затем охладить во льду.

2) При электротрансформации лигазной смеси необходимо произвести очистку ДНК от фермента (на спин-колонках или фенол-хлороформной экстракцией)

Условия хранения: -20^оС

ДНКаза I - эндонуклеаза, расщепляющая одно- и двухцепочечную ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов и монодезоксинуклеотидов с 5’-фосфатом и 3’-OH.

Так как фермент рекомбинантный, его раствор не содержит РНКаз.

Активность ДНКазы I зависит от присутствия ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, а также Mn²⁺. В присутствии Mg²⁺ фермент расщепляет каждую цепь двухцепочечной ДНК независимо друг от друга, случайным образом. В присутствии Mn²⁺ расщепление обеих цепей двухцепочечной ДНК происходит приблизительно в одном и том же месте, при этом концы фрагментов ДНК - тупые или выступающие на 1-2 нуклеотида.

Применение:

• Получение препаратов РНК, не содержащих примеси ДНК;
• расщепление матрицы ДНК после транскрипции in vitro;
• обратная транскрипция;
• мечение ДНК методом ник-трансляции (с использованием ДНК-полимеразы I);
• изучение взаимодействий «ДНК-белок» методом футпринтинга;
• получение библиотек вставок ДНК, перекрывающихся случайным образом.

Фермент комплектуется двумя 10-кратными реакционными буферами - с MgCl₂ и без MnCl₂

Важно! ДНКаза I чувствительна к физической денатурации - не перемешивать на вортексе или пипетированием. Перемешивать только переворачиванием пробирки.

Условия хранения: -20^оС

Ингибитор RiboLock ингибирует активность РНКаз А, В и С по неконкурентному механизму в соотношении 1 : 1. Не ингибирует эукариотические РНКазы T1, T2, U1, U2, CL3 и прокариотические РНКазы H и I.

Работает в большинстве реакционных смесей и защищает РНК от деградации при температурах до +55^оС.

Рекомендуемая рабочая концентрация - 1 ед/мкл.

В состав буфера для хранения входит ДТТ, который обеспечивает стабильность ингибитора, но не является необходимым компонентом реакционной смеси.

Области применения:

• Предохранение РНК от деградации при транскрипции и трансляции in vitro, обратной транскрипции, амплификации РНК, выделении мРНК-протеинового комплекса из клеток млекопитающих;
• выделение и хранение РНК;
• исследование специфической РНКазной активности.

Условия хранения: -20^оС

ИПТГ (Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) - высокостабильный аналог лактозы. Он инактивирует lac-репрессор и индуцирует синтез бета-галактозидазы, фермента, метаболизирующего лактозу. Используется как индуктор экспрессии генов, клонированных под контроль lac-оперона.

Также используется совместно с X-Gal для бело-голубой селекции клонов.

Рекомендуется приготовление стокового раствора в концентрации 100 мМ. Для бело-голубой селекции используется конечная концентрация 0.1 мМ.

Условия хранения: +4^оС

Водный раствор хлорида магния, отфильтрованный через мембрану 0.22 мкм. Предназначен для оптимизации условий ПЦР. Совместим со всеми полимеразами Thermo Scientific -Taq, DreamTaq, Phusion и др. Также может использоваться в качестве ко-фактора в других ферментативных реакциях.

Не содержит эндо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Условия хранения: -20^оС