ДНКаза I - эндонуклеаза, расщепляющая одно- и двухцепочечную ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов и монодезоксинуклеотидов с 5’-фосфатом и 3’-OH.
Так как фермент рекомбинантный, его раствор не содержит РНКаз.
Активность ДНКазы I зависит от присутствия ионов Ca2+
и Mg2+, а также Mn2+. В присутствии Mg2+
фермент расщепляет каждую цепь двухцепочечной ДНК независимо друг от друга, случайным образом. В присутствии Mn2+ расщепление обеих цепей двухцепочечной ДНК происходит приблизительно в одном и том же месте, при этом концы фрагментов ДНК - тупые или выступающие на 1-2 нуклеотида.
Применение:
Получение препаратов РНК, не содержащих примеси ДНК;
расщепление матрицы ДНК после транскрипции invitro;
обратная транскрипция;
мечение ДНК методом ник-трансляции (с использованием ДНК-полимеразы I);
изучение взаимодействий «ДНК-белок» методом футпринтинга;
Фермент комплектуется двумя 10-кратными реакционными буферами - с MgCl2
и без MnCl2
Важно! ДНКаза I чувствительна к физической денатурации - не перемешивать на вортексе или пипетированием. Перемешивать только переворачиванием пробирки.
Полинуклеотидканаза катализирует перенос фосфата от АТФ на 5’ конец ДНК или РНК, используется для концевого мечения НК, фосфорилирования праймеров, удаления 3’- фосфорильных групп. Рекомбинантная форма, выделенная из E. coli.
Буфер хранения: 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин.
Условия определения активности: 70 мМ трис-HCl рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, 66 мкМ [g32Р] АТФ, 20 мкМ 18-20-мерный гетеродезоксиолигонуклеотид.
Определение единицы активности:
Одна единица активности соответствует количеству фермента, катализирующему включение 1 нмоль [32Р] в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37 °С.
Полинуклеотидкиназа Т4 катализирует перенос гамма-фосфата от АТФ на 5’-концевую ОН-группу ДНК, РНК, олигонуклеотидов или нуклеозид-3’-монофосфатов (прямая реакция).Эта реакция обратимая. В присутствии АДФ полинуклеотидкиназа проявляет 5’-фосфатазную активность и катализирует обмен фосфатными группами между 5’-фосфорилированными полинуклеотидными цепями и АТФ (реакция обмена). Также фермент обладает 3’-фосфатазной активностью.
Полинуклеотидкиназа Т4 от Thermo Scientific активна в рестриктазных буферах, лигазном буфере и буфере для обратной транскрипции.
Области применения:
Мечение 5’-концов нуклеиновых кислот с целью получения гибридизационных зондов, зондов для транскриптов, маркеров для электрофореза, праймеров для секвенирования и ПЦР;
5’-фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов, ПЦР-продуктов, ДНК и РНК перед лигированием;
выявление модификаций ДНК с помощью [32P];
отщепление 3’-концевых фосфатов.
Полинуклеотидкиназа Т4 Thermo Scientific комплектуется 10-кратными буферами А (для прямой реакции), В (для реакции обмена) и 24% раствором ПЭГ 6000.
Полиэтиленгликоль повышает эффективность реакции фосфорилирования и используется в реакции обмена.
Важно! Полинуклеотидкиназа ингибируется ионами аммония, поэтому при осаждении фосфорилируемой ДНК рекомендуется использовать ацетат натрия.
