Мечение нуклеиновых кислот

ДНКаза I - эндонуклеаза, расщепляющая одно- и двухцепочечную ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов и монодезоксинуклеотидов с 5’-фосфатом и 3’-OH.

Так как фермент рекомбинантный, его раствор не содержит РНКаз.

Активность ДНКазы I зависит от присутствия ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, а также Mn²⁺. В присутствии Mg²⁺ фермент расщепляет каждую цепь двухцепочечной ДНК независимо друг от друга, случайным образом. В присутствии Mn²⁺ расщепление обеих цепей двухцепочечной ДНК происходит приблизительно в одном и том же месте, при этом концы фрагментов ДНК - тупые или выступающие на 1-2 нуклеотида.

Применение:

• Получение препаратов РНК, не содержащих примеси ДНК;
• расщепление матрицы ДНК после транскрипции in vitro;
• обратная транскрипция;
• мечение ДНК методом ник-трансляции (с использованием ДНК-полимеразы I);
• изучение взаимодействий «ДНК-белок» методом футпринтинга;
• получение библиотек вставок ДНК, перекрывающихся случайным образом.

Фермент комплектуется двумя 10-кратными реакционными буферами - с MgCl₂ и без MnCl₂

Важно! ДНКаза I чувствительна к физической денатурации - не перемешивать на вортексе или пипетированием. Перемешивать только переворачиванием пробирки.

Условия хранения: -20^оС

Полинуклеотидканаза катализирует перенос фосфата от АТФ на 5’ конец ДНК или РНК, используется для концевого мечения НК, фосфорилирования праймеров, удаления 3’- фосфорильных групп. Рекомбинантная форма, выделенная из E. coli.

Буфер хранения: 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин.

Условия определения активности: 70 мМ трис-HCl рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 5 мМ ДТТ, 66 мкМ [g³²Р] АТФ, 20 мкМ 18-20-мерный гетеродезоксиолигонуклеотид.

Определение единицы активности:

Одна единица активности соответствует количеству фермента, катализирующему включение 1 нмоль [³²Р] в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37 °С.

Хранение и транспортировка при -20 °С.

Полинуклеотидкиназа Т4 катализирует перенос гамма-фосфата от АТФ на 5’-концевую ОН-группу ДНК, РНК, олигонуклеотидов или нуклеозид-3’-монофосфатов (прямая реакция).Эта реакция обратимая. В присутствии АДФ полинуклеотидкиназа проявляет 5’-фосфатазную активность и катализирует обмен фосфатными группами между 5’-фосфорилированными полинуклеотидными цепями и АТФ (реакция обмена). Также фермент обладает 3’-фосфатазной активностью.

Полинуклеотидкиназа Т4 от Thermo Scientific активна в рестриктазных буферах, лигазном буфере и буфере для обратной транскрипции.

Области применения:

• Мечение 5’-концов нуклеиновых кислот с целью получения гибридизационных зондов, зондов для транскриптов, маркеров для электрофореза, праймеров для секвенирования и ПЦР;

• 5’-фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов, ПЦР-продуктов, ДНК и РНК перед лигированием;

• выявление модификаций ДНК с помощью [³²P];

• отщепление 3’-концевых фосфатов.

Полинуклеотидкиназа Т4 Thermo Scientific комплектуется 10-кратными буферами А (для прямой реакции), В (для реакции обмена) и 24% раствором ПЭГ 6000.

Полиэтиленгликоль повышает эффективность реакции фосфорилирования и используется в реакции обмена.

Важно! Полинуклеотидкиназа ингибируется ионами аммония, поэтому при осаждении фосфорилируемой ДНК рекомендуется использовать ацетат натрия.

Условия хранения: -20^оС