Секвенирование методом Сэнгера. Часть 1. Сущность и назначение капиллярного секвенирования и фрагментного анализа

17.08.2021
Сущность и назначение капиллярного секвенирования и фрагментного анализа

Капиллярное секвенирование и фрагментный анализ – принципиально различающиеся технологии, основанные на капиллярном электрофорезе и требующие использования капиллярного секвенатора. В этом состоит принципиальное отличие методов от NGS секвенирования, использующего высокопроизводительный секвенатор.

Капиллярное секвенирование позволяет определять последовательность фрагмента ДНК длиной от 400 до 1000 пар оснований, если речь об идеально подготовленном образце.

Фрагментный анализ позволяет определить относительный размер фрагмента ДНК – не абсолютный, а только размер относительно друг друга, но именно такая технология позволяет решать множество задач, которые ставят перед собой исследователи.

Принципиальные различия капиллярного и высокопроизводительного секвенирования

Сущность технологии капиллярного секвенирования в том, что по тонкому капилляру, заполненному специальным гелем (который служит матрицей для разделения) движутся флуоресцентно меченные фрагменты ДНК, собираясь по одинаковым размерам. Они разделяются примерно так же, как в агарозном форезе, но с намного большей точностью.

Принципиальные различия капиллярного и высокопроизводительного секвенирования

Фрагменты движутся по капиллярам группами, проходя мимо лазеров, при этом происходит возбуждение флуоресценции в группах, которые были предварительно «посажены» на эти фрагменты. Далее они проходят мимо окна детекции CCD камеры, где снимается сигнал, который затем будет обработан с получением аккуратных пиков, свидетельствующих о каждом зафиксированном нуклеотиде.

Следует отметить особенность метода, ограничивающую его применимость для исследования минорных аллелей.

Дело в том, что если в смеси присутствует минорный аллель в низкой процентной представленности (1-3%), и его фрагмент будет равен по длине фрагментам «дикого типа», а потому будет двигаться мимо лазера вместе с этими фрагментами равной длины, к сожалению, сигнал от него система не сможет считать: сигнал флуоресценции от фрагмента минорного аллеля будет заглушаться флуоресценцией фрагментов «дикого типа».

Однако у ThermoFisher Scientific есть несколько решений, позволяющих существенно увеличить точность работы технологий для таких задач. Например, программное обеспечение Minor Variant Finder позволяет детектировать порядка 5% минорного аллеля. Некоторые исследователи применяют SNaPshot технологию, но это все-таки косвенные методы, которые не назовешь массовыми. При работе с минорными аллелями лучше делать ставку на высокопроизводительное секвенирование, понимая ограничения метода.

Если мы говорим о высокопроизводительном секвенировании, сигнал с каждой отдельной молекулы ДНК или фрагмента снимается прибором индивидуально и только после того, как был снят сигнал, все фрагменты картируются на референс, а потом формируется некий консенсусный пик – консенсусное значение нуклеотида, которое фактически эквивалентно одному пику капиллярного секвенатора.

Поэтому при выборе технологии нужно обращать внимание на эту особенность.

Сфера применения секвенирования и фрагментного анализаСфера применения секвенирования и фрагментного анализа

Проведенные несколько лет назад исследования среди 2,5 тысяч пользователей из США и Европы (но не России) показали, что на текущий момент капиллярные секвенаторы активно используются в самых разных направлениях, но чаще всего в клонировании, исследовании наследственных заболеваний, подтверждении данных NGS и генном редактировании. Действительно, обе технологии эффективны для клинических исследований по различным, прежде всего наследственным патологиям, а также для идентификации личности.

Секвенирование по Сэнгеру используется для определения какой-либо искомой последовательности, для таргетного секвенирования, а также для разного типа задач, в том числе медицинских – например, панель для таргетного секвенирования может быть настолько мала, что использовать высокопроизводительное секвенирование нерентабельно.

Кроме того, несмотря на популярность высокопроизводительного секвенирования, ряд получаемых с его использованием данных желательно подтверждать другими методами – в том числе капиллярным секвенированием.

Технология используется не только при редактировании генома, но и в микробиологических исследованиях и для секвенирования митохондриального генома.

«Клетка, я тебя знаю?»Интерес к капиллярному секвенированию

Интерес к капиллярному секвенированию растет в разных отраслях. Например, с недавних пор метод стал популярен для аутентификации клеточных линий.

Это нужно это, чтобы убедиться, что исследователь имеет дело именно с той клеточной линией, с которой запланирована работа, а значит, качество получаемых данных гарантировано и статью о проведенных исследованиях примут к публикации без сомнений.

Для современных исследователей это актуально: ряд широко цитируемых международных научных журналов ввел данное правило как обязательное для идентификации и аутентификации клеточных линий перед подачей работ. А все потому, что не так давно обнаружилось: в большом ряде работ были заявлены одни клеточные линии, в действительности же использовались совсем не те, что были заявлены.

Поэтому исследователям хорошо бы либо иметь свой секвенатор, либо возможность отдавать на аутсорсинг задачу для того, чтобы убедиться в «правильности» клеточной линии.

У ThermoFisher Scientific есть полное решение для идентификации клеточных линий: наборы для отбора материала, амплификации – прямой либо через стадию выделения ДНК и с возможностью использования производимых компанией секвенаторов. Оценка данных проводится с использованием программы для клеточного анализа GeneMapper – самой мощной по функционалу.

«Миссия – отредактировать геном»Капиллярное секвенирование и фрагментный анализ в редактировании генома

В редактировании генома капиллярное секвенирование и фрагментный анализ тоже набирают обороты и становятся все популярнее.

ThermoFisher Scientific разработал полный рабочий процесс для всех этапов редактирования генома. В этом процессе важно проверять вставку, которую планировалось осуществить в имеющийся геном, чтобы подтвердить полученный результат. Это можно осуществить с помощью капиллярного секвенирования.

Против рисков и генетических «поломок»

В клинических и клинико-научных лабораториях все востребованнее задача оценки микросателлитной нестабильности.

Это явление присуще в первую очередь раковым клеткам. На рисунке изображено два возможных сценария развития у раковой клетки – в сторону потери гетерозиготности, когда у хромосомы теряется целый кусок, и в сторону микросателлитной нестабильности, когда у разных хромосом на определенных участках микросателлитные повторы содержатся в разном количестве, которое может довольно сильно варьировать.

Микросателлитные фрагменты – это небольшие повторяющиеся фрагменты (двух-, трех-, четырехнуклеотидные), которые могут повторяться разное количество раз в консервативных областях. В случае микросателлитной нестабильности количество этих тандемных повторов может существенно различаться.

Сейчас ведутся серьезные исследования по поискам путей оценки микросателлитной нестабильности.

Поиски путей оценки микросателлитной нестабильностиВ нашем организме существует система репарации неспаренных оснований, которая работает как раз для того, чтобы убрать подобные огрехи в геноме, и эта система кодируется шестью генами. Но в ней могут случаться поломки наследственного или ненаследственного типа.

Если мы говорим о поломках наследственного типа, это называется синдромом Линча у детей. Ненаследственные поломки вызывают накопление микросателлитной нестабильности у пациента, и такие аномалии очень сильно взаимосвязаны с различными типами рака – колоректального (именно в его исследовании впервые обратили внимание на само явление микросателлитной нестабильности), рака желудка, эндометрия, тонкого кишечника.

Сейчас исследователи ищут как можно большее количество маркеров, потому что выяснилось: пациенты по-разному отвечают на разные типы терапии, и оказалось, что микросателлитная нестабильность и ее процентная представленность влияет и на чувствительность опухоли к терапии, и на риск рецидива заболевания. Есть определенные стандартные маркеры, которые принято контролировать, в том числе для грамотного назначения терапии, в том числе иммунотерапии. Сейчас ищут дополнительные маркеры, позволяющие выбрать оптимальный вариант.

Классическими методами исследованиями явления были количественная ПЦР и иммуногистохимия, одним из вариантов в оценке микросателлитной нестабильности стал метод высокопроизводительного секвенирования, но есть решения и для капиллярного секвенирования.

ThermoFisher Scientific для таких целей разработал новый продукт – готовое коробочное решение TrueMark. Он включает 13 маркеров микросателлитной нестабильности, включая 5 основных, обязательных маркеров, которые исследуют все. Причина такого широкого охвата в том, что пока влияние микросателлитной нестабильности на выбор терапии окончательно не определено, ясно только, что это важный параметр – и ученые стараются найти разные маркеры и подходы, понимая, чем больше маркеров в данном случае – тем лучше.

Контроль при использовании этого решения есть, но при запуске не всегда требуется. Так что можно больше образцов «прогнать» за один запуск, к тому же в предлагаемом процессе – капиллярном секвенировании – полностью автоматизирован анализ данных, что исключает человеческий фактор и обеспечивает объективность информации. И это достаточно быстрый процесс, дающий высокое качество получаемых результатов даже при работе с парафинизированными блоками или очень маленьким количеством материала.

Набор для такого анализа включает мастермикс и праймеры, а также два «контроля» и бесплатное программное обеспечение для обработки данных.

Если сравнивать предлагаемый подход с классическим методом иммуногистохимии, то метод капиллярного секвенирования позволяет работать с гораздо меньшим количеством материала, оценивать большее количество маркеров, появляется возможность мультиплексирования и введения большого количества данных.


Возврат к списку

Ваш заказ будет обработан
в ближайшее время.
Мы пришлем уведомление, как только все будет готово. Спасибо!