Решения ThermoFisher Sientific для анализа белков

15.04.2022
Использование системы iBright

Часть 2. Визуализация результатов в вестерн-блоттинге

Содержание статьи:

Система iBright

Мембрану, на которой произошло связывание антител с белками, для которых они специфичны, пользователь далее отправляет в гель-документирующую систему, которая позволяет работать с изображением.

ThermoFS создала для этих целей систему iBright – прибор, позволяющий визуализировать гели и мембраны с помощью хемилюминесценции и флюоресценции. Основное его преимущество в том, что он получает очень хорошие изображения.

Способствует этому камера с разрешением 9,1 Мп – на сегодня это самое лучшее разрешение камеры на рынке. Так что изображения она дает очень качественные.

Прибор оснащен механическим поворотным столиком, который можно повернуть на 10 градусов в одну и другую стороны. Это нужно для первоначального выравнивания геля или мембраны, которую положили не совсем ровно. Конечно, можно исправить перекос снимка в графическом редакторе, но пиксели, которые имеют форму квадрата, при повороте будут пересчитываться. Это приведет к размыванию бэндов, что не так критично, когда бэнды хорошие, но может стать помехой, когда искомого белка очень мало (а такая ситуация нередка). Полоску, соответствующую этому белку, нужно затем вытягивать, и даже небольшой ее поворот в графическом редакторе еще больше размоет такой бэнд и затруднит анализ результатов.

Дисплей системы iBright

А прибор сам автоматически поворачивает столик на столько градусов, сколько нужно для выравнивания рассматриваемой мембраны. В графический редактор попадут все пиксели без искажений, и это преимущество использования данного оборудования.

Прибор имеет автофокус и автоэкспозицию, автоматический подбор параметров выдержки. Пользователь может дополнительно настроить все параметры вручную, но первоначальные автоматические настройки у iBright оптимальны.

Еще две уникальные особенности прибора – пять каналов флюоресценции и бининг. Суть бининга в пересчете пикселей путем их объединения. Например, по 4 пикселя изображения по горизонтали и вертикали у изображения, снятого камерой, объединяются и на обработанном изображении это будет уже один пиксель. Так повышается чувствительность. У этого прибора бининг до 16х16: если у пользователя действительно бэнд очень плохо виден, можно объединить эти пиксели и сделать бэнд более заметным, более ровным – пересчитать. Пиксели, которые были серыми, объединяются и становятся после такой обработки черными – видимость бэнда повышается.

Возможности прибора можно прочувствовать, если нарисовать произвольное изображение, используя разные флюоресцентные краски.

Такие технические «сложности» нужны для того, чтобы минимизировать различные побочные эффекты, влияющие на результат фореза. Например, в одной из лабораторий делали форез на готовых гелях и все до определенного момента шло замечательно, пока не включили отопление в лаборатории. Один бок геля, расположенный ближе к мощной батарее, начал высыхать быстрее, и видимые результаты стали искажаться. В рутинных экспериментах для рядового скрининга качество изображения может быть не столь критичным, как в случае, если результаты вместе с иллюстрацией лягут в основу публикации в журнале или предназначены для обсуждения с коллегами. В таких случаях нужна четкость и воспроизводимость результата.

Рисунки iBright

Рассмотрим рисунки на iBright.

Рисунки на iBright

Часть прибора, в которую вставляется мембрана или гель для съемки изображения, имеет достаточно высокий зазор, который позволяет рассмотреть даже чашки Петри: некоторые исследователи выращивают дрозофил, у которых есть определенный цикл, и если белки GFP активируются, тоже можно посмотреть через прибор: присутствует у них определенная мутация или нет. Так что можно вставить в камеру различные объекты, не боясь испачкать камеру. А стеклянный столик легко снимается и его можно очистить.

Прибор подскажет, как выбрать экспозицию. В нем есть разные режимы: для хемилюминесценции, для флюоресценции, для нуклеиновых кислот, для белков, а также универсальный режим – на случай, если у пользователя в образце присутствует и окрашенная часть (маркёр), и хемилюминесценция.

Дисплей прибора iBright

Настройки прибор сохраняет для каждого канала, можно отдельно для них выбрать время экспозиции, поработать с яркостью и контрастностью.

Когда пользователь добился нужных настроек, можно снять изображение и сохранить его: в облаке в соответствующем профиле в OneDrive, с которым можно связать прибор. Тогда можно просто по облаку, по сети перебрасывать такую информацию без флешки. При этом можно каждому сотруднику задать свой логин и пароль – каждый пользователь будет заходить только в свой личный кабинет, конфиденциальность данных сохранится – никто не посмотрит чужие данные и не сможет их использовать или править. Но можно сохранить изображение на флешку, компьютер или ноутбук.

Прибор снимает каждый канал снимает отдельно, и сохранять изображения можно в нескольких форматах: просто в .jpg, в .tif и при этом указать, чтобы каждый канал был сохранен отдельно (тогда в графическом редакторе работать можно не со слитой картинкой, а с изображением, полученным по каждому каналу). Можно сохранить изображение и в собственном формате прибора, а потом обработать в бесплатной программе.

У прибора очень много настроек. Например, ему можно задать регион интереса на изображении – и прибор будет настраивать экспозицию и автофокус по этому выбранному участку. Также можно настраивать псевдоцвета.

Работа на iBright

Есть еще одна важная опция: в приборе можно смотреть не только белки, но и нуклеиновые кислоты. Режим работы с нуклеиновыми кислотами и режим вырезания фрагмента из геля у этого прибора есть специальный: подсветка производится не ультрафиолетовым светом, а зеленым. У этидиумбромида два спектра возбуждения: один ультрафиолетовый, другой в зеленой области, но ультрафиолет делает сшивки – с таким фрагментом далее могут возникнуть проблемы, если нужно сохранить его структуру для клонирования или чего-то еще. А зеленый свет более экологичен, он не делает сшивок в нуклеиновых кислотах, то есть можно спокойно вырезать исследуемый фрагмент прямо здесь на стеклянном столике, а затем выделить его из геля и продолжать работу с ним. И для глаз этот режим тоже благоприятнее.


Возврат к списку

Ваш заказ будет обработан
в ближайшее время.
Мы пришлем уведомление, как только все будет готово. Спасибо!