История
История
Эта публикация отражает содержание доклада «Подходы к исследованию образцов неизвестного состава», прочитанного на мультиконференции «Диаэм» 9 ноября 2022 года.
Заместитель заведующего лабораторией физико-химических методов анализа Томского государственного университета (партнера «Диаэм» по мультиконференции) Дмитрий Кургачев рассказал о некоторых приемах и решениях в реверс-инжиниринге — области исследований, необходимой для изучения образцов неизвестного состава.
Обычно при этом требуется максимально полно разложить имеющийся образец с целью понять не только состав, но и технологию, по которой он был произведен.
С иронией называя реверс-инжиниринг своеобразным «колдовством», докладчик рассказал, какие параметры образца неизвестного состава можно определить, имея в своем арсенале только ВЭЖХ и в ряде случаев больше не пользуясь вообще никакими другими методами.
Имея ВЭЖХ с диодной матрицей или даже просто с лучевым УФ детектором, можно, пользуясь техникой скаутинга («RP Gradient Scouting»), определить качественный состав образца: сколько компонентов в него входит, сколько сигналов, соответствующих разным соединениям, у исследователя получится.
В данном случае даже не нужно ничего разрабатывать: готовое решение, то есть готовая техника уже в наличии, и она может быть очень полезной при изучении состава, например, референтного лекарственного препарата, какого-то растительного сырья, а также напитков или пищевых продуктов (чтобы понять, сколько и каких компонентов — стабилизаторов, красителей и т. д. — туда добавили).
С помощью ВЭЖХ хорошо можно определить параметр log P — меру «жирности» вещества, то есть меру того, насколько вещество является липофильным и насколько лучше растворяется в маслах по сравнению с водой.
С помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ можно установить ориентировочное или даже точное (при большом желании) значение коэффициента log P для какой-то неизвестной молекулы. Если при этом есть хоть какая-либо другая дополнительная информация о составе такой молекулы — например, к какому классу соединений она относится и какими функциональными группами обладает, можно, пользуясь разными базами данных, вообще точно установить, что это за соединение.
Например, при исследовании замещенного бензоазепина в зависимости от характера заместителя будет различаться log P соединения. Если определить его на основе данных ВЭЖХ, можно, не имея никакого стандартного образца и больше вообще никакого оборудования, в принципе либо определить структуру вещества, либо хотя бы существенно сузить себе поиск.
Как определить этот показатель?
Это делается одновременно со скаутингом, так что при определении липофильности «сильно думать не нужно», все легко находится по этой строчке.
А вот pKa соединения найти уже сложнее, хотя техника такого эксперимента также может быть найдена в Интернете.
Что такое pKa? Это логарифм константы диссоциации кислоты. Для такого эксперимента нужно иметь минимум одну, лучше две хроматографические колонки со смешанным механизмом адсорбции — обращенно-фазовая плюс какой-то из ионообменников («катионник» или «анионник»).
В случае, если вещество нейтральное, оно будет на той и другой колонках выходить примерно в одно и то же время вне зависимости от pH подвижной фазы и содержания либо отсутствия соли в подвижной фазе.
Если вещество проявляет кислотные свойства, катионообменнике удерживание будет значительно слабее, а при добавлении соли в подвижную фазу удерживание будет показывать заметный рост. На анионообменнике для кислоты будет наблюдаться зеркальная картина: добавление соли приведет к падению удерживания.
Если вещество обладает основными свойствами (например, это амин), на анионообменнике при добавлении соли будет снижаться отталкивание, удерживание аминов на анионообменнике будет нарастать. А на катионообменной колонке для такого соединения добавлении соли приведет к падению удерживания.
Имея такие колонки и меняя ионную силу подвижной фазы, можно численно определить значение константы кислотности неизвестной кислоты по скачку удерживания (времени выхода) за счет ионной эксклюзии. Это будет похоже на скачок титрования.
Такой подход очень удобен, чтобы определить, имеет вещество кислотную или основную природу. И в данном случае ничего, кроме ВЭЖХ, не потребуется, никакое другое оборудование будет не нужно.
«Если вы это сделаете вам не поверят: все будут считать, что вы совершили некое колдовство», — отмечает автор доклада.
Еще один параметр, который можно определить с помощью ВЭЖХ на диодной матрице — это строение π-сопряженной системы.
На химических факультетах в курсе органической химии или строения вещества изучают, как по структуре вещества построить его УФ спектр, а по спектру —воспроизвести строение исследуемой молекулы. В данном случае нужны знания о запрещенных и разрешенных переходах π→π∗, n→π и т. д.
Если у вещества есть характерный спектр, то можно, пользуясь отраслевыми стандартами или используя дополнительную информацию, просто взять и расшифровать структуру: какие кольца присутствуют исходя из спектральных данных, сколько и в каком положении у молекулы заместителей, какие они и какие эффекты будут наблюдаться в молекуле — конечно, ориентировочно.
Существует огромное количество отраслевых баз. Например, в фармацевтике есть справочник Кларка («Clarke's Analysis of Drugs and Poisons») — это 6000 страниц (доступны в виде книги в pdf формате онлайн в открытом доступе) — это просто база данных УФ и ИК спектров.
Есть источник Drug reference standard, в котором открыт доступ к фармакопеям азиатских стран и приложениям в виде библиотечных спектров различных соединений: исследователи просто размещают там картинки УФ и ИК спектров разных веществ, что очень удобно.
Итак, с помощью только ВЭЖХ и вообще без использования других приборов можно установить
Можно дать еще несколько бесплатных рекомендаций для этого направления исследовательской работы.
Всегда приятно если есть доступ к ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и элементному анализу.
ЯМР-спектрометр есть почти в каждом крупном вузе, в частности, в университетах крупных городов. А значит, можно договориться с такими вузами и за относительно небольшую плату зарегистрировать ЯМР-спектры исследуемых образцов.
Любые масс-спектрометры вообще прекрасно стыкуются с любыми ВЭЖХ! Всегда приятно иметь доступ «ВЭЖХ-МС», потому что это дает высокую информативность.
Нужен почти всегда, если в образце могут быть какие-то элементные или металлические примеси или даже некоторые неметаллы.
Автор доклада постулирует: если у исследователя есть доступ к ВЭЖХ, масс-спектрометру, ЯМР-спектрометру и элементному анализатору, то в принципе можно определить состав любого или почти любого образца даже бесконечной сложности, включая природное сырье, смазочное масло, лекарственное средство или пищевой продукт.
Пример 1: нужно провести идентификацию примеси в лекарственном средстве, то есть некой таблетке, в которой есть 0,2 % не идентифицированной примеси — это порог идентификации по ICH. Каково самое лучшее решение по соотношению стоимости исполнения время / правильность и точность?
ВЭЖХ даст нам только хроматограмму. Быстрее и дешевле всего нужный результат даст сочетание ВЭЖХ и масс- спектрометрии.
Если у исследователя нет своего МС, нужно договариваться с любым университетом, который есть поблизости и скорее всего располагает оборудованием для тандема «ВЭЖХ-МС» — и совместно с таким вузом задача решается.
Пример 2: анализ сплава, например, фрагмента арматуры.
Для этого пригодится элементный анализатор, какой-нибудь ICP-AES (с индуктивно связанной плазмой) или сочетание ICP-MS.
Пример 3: природный экстракт, масло пихты или экстракт шиповника, и пользователю нужно определить растение, тип сырья, где и как оно было собрано, то есть получить какую-то информацию поточнее.
Что применить? Газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией: почти все натуральное «летит» (хоть что-то, да «полетит»), и ГХ-МС — это отличное сочетание методов для изучения природных объектов, за редкими исключениями.
В Томске лаборатория, которую представляет автор доклада, ведет специальные курсы по ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Если кому-то понадобится проводить реверс-инжиниринг, эту задачу можно решить на базе упомянутой лаборатории либо, что лучше, научить своих сотрудников заниматься такими исследованиями.
Учреждение предлагает спецкурсы по газовой хроматографии, хромато-масс-спектрометрии в контроле качества лекарственных средств, ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС («Применение жидкостной масс-спектрометрии в разработке и контроле качества лекарственных средств»), ЯМР-спектроскопии с индивидуальной стажировкой (например, обучение по курсу «Применение ЯМР-спектроскопии для установления структуры органических соединений» проходит с наставником один участник).
Информацию обо всех курсах можно получить по приведенной ссылке http://lpcma.tsu.ru/education, по ней же можно отправить запрос на проведение исследований. Специалисты могут дать консультации, чаще всего даже бесплатные. Можно также обратиться лично к автору доклада, написав через сайт, на почту лаборатории или kurgachev.tsu@gmail.com.
Страница мультиконференции: 09.11.22. «Life Sciences, биотехнологии и аналитическая химия в современных условиях. Взгляд на Восток?»
Другие видео мультиконференции:
С помощью личного кабинета Вы сможете:
