Оборудование для выделения, количественной оценки и анализа нуклеиновых кислот

Содержание статьи:

• Ключевые этапы подготовки проб при исследовании НК
• Гомогенизация нативного образца
  • Ручной метод
  • Автоматизация процесса гомогенизации пробы
  • Гомогенизаторы MP Biomedicals
  • Гомогенизаторы Bioprep от Allsheng
• Выделение нуклеиновых кислот и белков из проб
  • Станции выделения НК от Allsheng
  • Продукция MB Biomedicals для выделения НК
  • Открытая система выделения НК от Nest
  • Линейка станций выделения НК от Bioer Technology
• Комбинированные станции Bioer Technology
• Измерение концентрации НК в пробе
  • Флуориметры от Allsheng

Российская продукция для флуориметрии Спектрофотометрия от Drawell ExDrop от Blue-Ray Biotech: спектрофотометрия - это легко! Прибор «Два в одном» от Allsheng

Эта публикация отражает содержание третьей части вебинара «Получение высококачественных ДНК и РНК: реагенты, наборы и оборудование – и новое, и старое», состоявшегося 29 сентября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм». Специалист-консультант «Диаэм» в Самаре Глеб Миронов рассказал об актуальном ассортименте оборудования для выделения, количественной оценки и анализа нуклеиновых кислот.

Ключевые этапы подготовки проб при исследовании НК

1 этап: отбор и подготовка клеточного материала к получению препаратов нуклеиновых кислот (белков): сбор образцов, их высушивание и измельчение, гомогенизация и частичный лизис образцов;

2 этап: получение препаратов нативной ДНК – выделение НК из клеточного материала, сорбция и очистка молекул НК;

3 этап: завершающей частьюпробоподготовки перед целевым анализом является количественный анализ и контроль качества нативной ДНК.

После этого можно начинать собственно исследование НК. Остановимся на аппаратном обеспечении описанных трех этапов и на том, какое оборудование, нужное при решении этих задач, может предложить сегодня «Диаэм».

Гомогенизация нативного образца

Далеко не все объекты (образцы) поддаются лизису без этого этапа. Это относится, в частности, к образцам растительной ткани: корням, листве, семенам, пыльце, древесине и другим. Ткани животных также могут представлять сложность, если речь о твердых (хитиновые панцири, кости, зубы, хрящи, волосы) и некоторых мягких тканях, которые не поддаются лизису без предварительной гомогенизации. Тем более относится это к тканям замороженным, если по условиям эксперимента не может быть выполнена предварительная разморозка перед дальнейшими этапами. Кроме того, исследователям приходится работать с тканями, фиксированными формалином, а также высушенными или дегидратированными. Не поддаются лизису некоторые микроорганизмы, такие как споры, дрожжи, различные микроорганизмы из сточных вод, окаменелых образцов и почвы.

Ручной метод

Простейший метод придания образцу однородности – сделать это вручную, например, с использованием ступки и пестика. Основные плюсы метода – доступность и отсутствие необходимости в дополнительном оборудовании, а также возможность его использования в полевых условиях. Но есть и существенные недостатки: низкая эффективность, потому что некоторые образцы в ступке измельчить невозможно, – скорее будет разрушена сама ступка, чем образец. Метод не позволяет гомогенизировать несколько образцов одновременно, обладает низкой производительностью, сочетает высокий риск контаминации и высокие затраты труда и времени пользователя.

Автоматизация процесса гомогенизации пробы

Существуют автоматизированные решения этой проблемы в виде автоматических гомогенизаторов. Преимуществ у них гораздо больше – это высокие эффективность и производительность, минимум трудозатрат пользователя и риска контаминации, возможность использования в полевых условиях и возможность гомогенизировать образцы без размораживания. Недостаток только один – необходимость в собственно оборудовании и расходных материалах. В ассортименте «Диаэм» представлены лабораторные гомогенизаторы разных производителей.

Гомогенизаторы MP Biomedicals

Первый заслуживающий упоминания – MP Biomedicals (Германия). У этого производителя есть линейка гомогенизаторов FastPrep с разными форматами. Есть гомогенизаторы формата FastPrep-24, FastPrep-24 5G – с роторами на 24 образца по 2 мл. К этим гомогенизаторам опционально доступны несколько адаптеров с форматами пробирок на 50, 15 и 4.5 мл.

Здесь на картинке изображен ротор (адаптер) CoolBigPrep 2x50 мл. Он позволяет подсыпать сухой лед к пробиркам, после чего гомогенизацию можно проводить без разморозки или при низких температурах. Также есть роторы формата 15 мл, 2 мл – существуют такие же с функцией заморозки. В ассортименте есть цельнометаллические адаптеры. Следующий формат гомогенизаторов – FastPrep-96: это стандартный формат на 96 пробирок. К этому гомогенизатору существуют адаптеры для пробирок на 250 мл, 50 мл, 4.5 и 15 мл, а также доступен адаптер ConeFlex, который позволяет использовать с гомогенизатором FastPrep-96 все адаптеры из линейки FastPrep-24. Кроме того, у MP Biomedicals есть портативный гомогенизатор для работы в полевых условиях – SuperFastPrep-2/. Формат адаптера у него один – на 2 пробирки по 2 мл. Но его можно носить с собой для работы в полевых условиях. На слайде представлен комплект к данному гомогенизатору: в него входит сам прибор, рукоятка, которая выполняет функцию ротора, два литий-ионных аккумулятора, сетевой адаптер на 220 В, станция зарядки аккумуляторов, набор матриксов для лизиса в пробирках и поддерживающее устройство, необходимое для установки пробирок непосредственно в сам адаптер. Также компания MP Biomedicals представляет широкий спектр матриксов –шариков для проведения гомогенизации – из разных материалов: кремния, керамики, оксида алюминия, стекла, циркония, нержавеющей стали. Компания дает некоторые рекомендации по использованию матриксов в зависимости от образца: от менее агрессивных к более агрессивным. Они представлены графически на следующем слайде:

Гомогенизаторы Bioprep от Allsheng

Заслуживают упоминания также доступные гомогенизаторы фирмы Allsheng. Линейка гомогенизаторов Bioprep представлена моделями на 6 образцов (Bioprep-6) и 24 образца (Bioprep-24, Bioprep-24R). Младшая модель Bioprep-6 позволяет гомогенизировать до шести образцов в пробирках на 2 мл либо два образца в пробирках по 5 мл. Это универсальный гомогенизатор, который позволяет гомогенизировать любой образец с высокой скоростью,с возможностью сохранения одной программы, а также с низким уровнем шума.

Для основных моделей на 24 образца опционально доступен адаптер на 12 образцов в пробирках до 5 мл. Это уже старшая модель Bioprep-24 с возможностью сохранения до 50 протоколов гомогенизации. У этих приборов регулируется скорость – до 7 м/с с шагом 0.05, частота оборотов – до 4260 об/мин с шагом 10, продолжительность цикла – до 90 с. с шагом 1, количество циклов – 10. Уровень шума составляет не более 70 дБ. И есть усовершенствованная модель Bioprep-24R с возможностью охлаждения. Вот эта крышка обладает функцией охлаждения до -10 ºС.

Кроме того, Allsheng представляет разнообразные матриксы – шарики для гомогенизации – различного диаметра и материалов, таких как: карбонат циркония, керамика, сталь и стекло.

Выделение нуклеиновых кислот и белков из проб

Как и в стадии пробоподготовки, выделение целевой НК или целевого белка можно провести вручную или использовать автоматизированные станции. Основные преимущества использования автоматизированных станций выделения нуклеиновых кислот :

- высокая производительность (до 96 образцов за 30 минут),

- точность, достоверность и воспроизводимость результатов,

- минимизация контакта пользователя с пробами и токсичными реагентами,

- высокая эффективность выделения НК, так как в автоматизированных станциях реализованы наиболее эффективные технологии сорбции НК на магнитных частицах или на силикатных мембранах,

- минимизация рисков перекрестного загрязнения объектов,

- минимизация ошибок пользователя.

В качестве эталона для станций автоматического выделения НК можно представить станцию KingFisher Flex от Thermo FS, которую, наверно, многие знают и использовали. В числе ее преимуществ – высокая производительность (до 96 образцов за запуск). В этой станции реализован метод сорбции нуклеиновых кислот на магнитных частицах. Лизис образцов происходит непосредственно в самой станции благодаря встроенному нагревательному модулю. Здесь есть возможность выделения нуклеиновых кислот из большого объема образца (до 5 мл), возможность редактирования протоколов выделения. Отсутствие пипетирующего элемента – тоже существенное преимущество: тот, кто использовал в работе станции автомат выделения с пипетирующим элементом, знает, что именно этот узел подвергается поломкам вследствие загрязнения, а неполадки в нем вызывают нарушения в работе всего устройства и влияют на результат работы. Преимущество этой станции для медицинских работников в том, что на нее выдано регистрационное удостоверение Росздравнадзора. Но, к сожалению, как и многие другие продукты ThermoFS, эта станция в настоящее время практически недоступна. Однако «Диаэм» предлагает ряд замен.

Станции выделения НК от Allsheng

Первая из них – станция Auto-Pure 96 от Allsheng – практически копия KingFisher Flex.

В этом приборе также используется 96-луночный формат: глубоколуночный планшет на 96 лунок и гребенки для магнитных стержней. Все этапы от лизиса до элюции также проходят внутристанции, ничего не надо переставлять, вынимать, доставать, перекапывать и т.д. Управление станцией происходит с помощью сенсорного дисплея и встроенного интуитивно понятного программного обеспечения. В зависимости от настроек протокола выделения один запуск может занять до 60 минут и меньее.

К преимуществам прибора можно отнести также возможность программирования протоколов и их сохранения пользователем. У станции есть встроенный УФ-модуль для предотвращения контаминации. Эта станция тоже имеет удостоверение Росздравнадзора, что позволяет ее использовать в медицинских учреждениях и не только в них.

Станция Mpure-32 aNAP System от MP Biomedicals несколько отличается по параметрам: у нее не одна магнитная гребенка с 96-ю стержнями, а 4 гребня по 8 стержней на каждом. Производительность станции составляет до 32 образцов за время до 45 минут в зависимости от настроек пользователя. В приборе 2 нагревательных блока, обеспечивающих температуру до 70 градусов – для лизиса нативного материала и для элюции нуклеиновых кислот в раствор. На станции возможно выделение широкого спектра образцов. У компании MP Biomedicals есть наборы для выделения на магнитных частицах, которые совместимы с этой станцией. На ней можно работать с самыми разными форматами образцов, включая экскременты, почву и другие сложные по составу образцы, FFPE (фиксированные формалином и залитые парафином образцы) – из всех них можно выделять НК на этой станции. Она обладает понятным управлением, снабжена почти сотней предустановленных протоколов выделения, есть в ней и возможность программирования собственных протоколов пользователя.

Открытая система выделения НК от Wuxi Nest

Заслуживает упоминания станция Techstar YC796 от компании Wuxi Nest. Ее основные преимущества в том, что она полностью открыта как для реактивов, так и для расходных материалов сторонних производителей. Станция высокопроизводительная: можно выделить НК максимум из 96 образцов в течение 35 минут. У прибора есть предустановленные протоколы и возможность программирования пользовательских протоколов, встроен УФ-модуль для предотвращения контаминации и перекрестного загрязнения образцов. Станция отличается удобным управлением и понятным интерфейсом, правда, все это на английском языке, пока станции не русифицированы. В целом это техника очень достойного уровня, у «Диаэм» есть демоверсия этой станции, и ее можно увидеть в работе, попробовать, как происходит запуск, программирование и т.д.

Линейка станций выделения НК от Bioer Technology

Далее представлены станции выделения от Bioer Technology. Эта китайская компания – один из лидеров китайского рынка по производству продуктов и решений для молекулярной биологии, молекулярной генетики, медицины и прочих смежных отраслей. У нее очень широкий ассортимент оборудования, и среди прочего компания представляет станции для автоматического выделения нуклеиновых кислот. Младшая модель – станция GenePure Pro 16H (NPA-16H) с производительностью до 16 образцов за запуск. Расходные материалы для нее довольно специфичны: здесь так же, как у станций MP Biomedicals на 32 образца, используются гребенки не на 48 или 96 магнитных стержней, а всего лишь на 4 стержня, но таких гребенок четыре. В качестве емкости, где происходит процесс выделения, используются стрипы, изображенные на слайде. Пользователям следует обратить внимание: у этих стрипов есть одно очень объемное отделение, куда можно налить до 10 мл нативного образца, то есть такая станция позволяет выделять нуклеиновые кислоты из больших объемов образцов. В ней реализовано в принципе все то же самое, что и у других станций: возможность редактирования протоколов, открытость для реагентов и магнитных частиц любых сторонних производителей, характерная для всех станций от Bioer Technology. Также у Bioer существуют собственные наборы, с которыми, по словам производителя, достигается наибольшая эффективность в работе. Управление станцией осуществляется с сенсорного дисплея, так что необходимости в стороннем компьютере нет. В станции есть встроенный УФ модуль для предотвращения контаминации – в этом плане нет конструкционных отличий от других станций.

Этот производитель представляет два варианта станций с производительностью до 32 образцов за 40 минут – GenePure Pro 32 (NPA-32P, NPA-32E). Эти приборы тоже используют глубоколуночные планшеты на 96 лунок и гребенки на 8 магнитных стержней – соответственно, таких магнитных гребенок в станции размещается четыре. Различие между моделями NPA-32P и NPA-32E состоит в следующем. Модель NPA-32P – это основная модель, а станция с индексом «E» обладает сниженным энергопотреблением, кроме того ее корпус изготовлен из других материалов, благодаря чему снижена масса прибора. Такая станция позиционируется в целом как наиболее экологичная, дающая меньше выбросов в окружающую среду при ее производстве. С помощью такой станции можно проводить выделение из широкого спектра исследуемых образцов, кастомизировать протоколы выделения. Система открыта для реактивов сторонних производителей – правда, насчет пластика пока такой уверенности нет. У этого производителя есть и 96-луночный формат станции – это высокопроизводительная станция GenePure Pro 96 (NPA-96, NPA-96T). Она позволяет получать до 96 проб за один запуск и также характеризуется непродолжительным периодом выделения (получения пробы). Станция оснащена двумя нагревательными модулями, дающими температуру до 120 градусов: один модуль для лизиса клеточного материала, второй для элюции. Программное обеспечение у нее то же самое: имеется возможность настройки протоколов и прочие общепринятые функции. Станция использует 96-луночный формат пластика – гребенку на 96 магнитных стержней и планшет на 96 лунок.

Комбинированные станции Bioer Technology

У компании Bioer Technology есть комплексное решение – комбинированные станции, которые позволяют проводить все этапы пробоподготовки от идентификации образца с помощью сканера штрихкодов до подготовки ПЦР-микса, а также (об этом несколько позднее) у этого производителя имеется станция, в которую встроен амплификатор в реальном времени. Особенность станции NPAs-9600 – наличие манипулятора для перемещения образцов и открытия крышек, то есть все этапы происходят без участия пользователя, они предварительно запрограммированы. Станция оснащена УФ-модулем и модулем фильтрации воздуха для предотвращения контаминации. Есть в ней и дозирующий модуль, который использует кондуктивные наконечники – электропроводящие наконечники, с помощью которых определяется уровень жидкости в пробирке. Станция обрабатывает образцы в пробирках 5 и 10 мл, а также в пробирках для вакуумного забора крови. Также в данной станции используются пробирки на 200 мкл, стрипы на 200 мкл по 8 шт и 96-луночный планшет на 200 мкл.

Последнее решение от компании Bioer Technology – это станция FQD-A1600, позволяющая проводить все этапы пробоподготовки, а затем реалтайм-ПЦР и анализ его результатов. Что касается реалтайма – это четырехканальная система, использующая красители FAM/SYBR Green I, VIC HEX/TET JOE, ROX/TEXAS RED, Cy5/Quasar-670 в соответствующих каналах. Станция не очень производительная – до 16 образцов за один запуск. Нагревательный блок обладает точностью поддержания температуры в точке 0.1 ºС и гомогенность температуры по блоку на уровне 0.4 ºС. Он обеспечивает достаточно высокую скорость нагрева (8 ºC/с) и охлаждения (5 ºС/с).

Измерение концентрации НК в пробе

Последний этап пробоподготовки – измерение концентрации целевых молекул в пробе и оценка ее пригодности для дальнейшего анализа. В качестве референсных приборов в этом процессе выступает флуориметр Qubit 4. На слайде представлен принцип флуориметрии. Для работы с этим прибором необходим интеркалирующий краситель, который будет специфично встраиваться в целевую молекулу. Далее излучатель будет воздействовать на этот краситель, и детектор будет фиксировать интенсивность его флуоресцентного свечения. Косвенным образом – по количеству флуоресценции – мы и будем определять концентрацию целевой молекулы в пробе. Преимущество этого метода – достаточно быстрое и точное измерение концентрации. Плюс именно флуориметра Qubit 4 – это возможность определения целостности молекул РНК при использовании специального набора. Также задача измерения концентрации может выполняться на спектрофотометрах. В этом случае в качестве референсного прибора выступает NanoDrop One – в отличие от предыдущего прибора, он детектирует не интенсивность флуоресцентного свечения, а количество поглощенных волн в УФ спектре – детекция происходит в диапазоне от 200 до 300 нм. Определение качества пробы происходит по соотношению поглощенного света на длинах 230, 260 и 280 нм. Как показано на слайде, по соотношению интенсивности поглощения на 260 и 280 нм будет оцениваться влияние на пробу нуклеиновой кислоты и влияние белков, а соотношение интенсивности поглощения на 260 и на 230 показывает влияние наличия примесей солей в пробе белка. В идеале нужно, чтобы два этих показателя были близки к 2 или 2.1 в зависимости от того, какую целевую молекулу мы исследуем. В ассортименте «Диаэм» есть альтернативные приборы, которые позволяют сделать все то же самое.

Флуориметры от Allsheng

Первый из них – флуориметр от Allsheng – Fluo-100 A/B. Прибор обладает двумя каналами детекции. Источником возбуждения является LED светодиод. Что касается фильтров возбуждения – они доступны в двух модификациях прибора: Fluo-100A – 365 нм, 460 нм, Fluo-100B – 450 нм, 625 нм. Эмиссионные фильтры, соответственно: для Fluo-100A – 420-479 нм, 525-570 нм, для Fluo-100B – 535-570 нм, 670-725 нм. Время измерения составляет всего 3 с! Нижний предел детекции – 0.5 пг на мкл. Прибор позволяет сохранять до 1000 измерений – обладает встроенной памятью, позволяющей хранить соответствующий объем данных.

Схема работы с прибором показана на слайде. На первом этапе нужно приготовить рабочий раствор красителей, с помощью него – калибровочные стандарты из набора. Также следует подготовить разведение образца. Далее следует перемешивание, инкубация, после чего можно получать данные. Российская продукция для флуориметрии Аналогичный российский прибор MAXLIFE Fluorimeter 2.0 от «МВМ-Диагностик» обладает только одним каналом детекции. В качестве источника возбуждения у него имеется светодиод с длиной волны 450-480 нм. В качестве детектора прибор оснащен полупроводниковым детектором с отсекающим светофильтром (>520 нм). Предел чувствительности прибора находится в диапазоне от 0,01 нг/мкл до 2000 нг/мкл. Возможность исследования образца – в объемах от 1 до 10 мкл.

В комплекте с флуориметром поставляется планшет с операционной системой Windows 10 и стартовый набор реактивов для измерения концентрации. Спектрофотометрия от Drawell Далее представлен спектрофотометр K5500Plus от китайской компании Drawell. Он обладает тем же функционалом, что и NanoDrop One:

• позволяет производить измерение концентрации биомолекул, плюс у него есть функция измерения оптической плотности при длине волны 600 нм.
• Длина оптического пути составляет 1 мм, объем исследуемого образца – 2 мкл.
• В качестве источника возбуждения в приборе используется ксеноновая лампа.
• Диапазон детекции – от 190 до 850 нм.
• Пределы чувствительности для нуклеиновых кислот: 1-750 нг/мкл, для белков – 0.1-40 мг/мл (по БСА).
• В качестве детектора прибор оснащен сенсором с 3684-мя элементами.

Из особенностей данного прибора стоит отметить возможность удаленного управления и распечатку результатов с помощью интерфейсов Bluetooth и WiFi, а также возможен импорт результатов в графическом и табличном формате с помощью USB порта. Управление прибором осуществляется с компьютера с операционной системой Windows 10. Прибор оснащен 32 ГБ встроенной памяти. EzDrop от Blue-ray Biotech: спектрофотометрия влегкую Прибор EzDrop 1000 от компании Blue-Ray Biotech ни в чем не уступает NanoDrop One. Он обладает тем же самым функционалом: производит измерение концентрации биомолекул, измеряет оптическую плотность при 600 нм. Длина оптического пути у него выставляется вручную и составляет 0.05 или 0.5 мм, время измерения – всего 3 с. Предел обнаружения нуклеиновых кислот – от 2 до 20 тыс нг/мкл. Это очень широкий диапазон. Белок он может обнаружить в концентрациях 0,06 – 600 мг/мл. В качестве источника возбуждения используется импульсная ксеноновая лампа, детектор – CMOS линейный сенсор из 2048 элементов. Прибор оснащен 32 ГБ встроенной памяти. Прибор «Два в одном» от Allsheng

Следующий прибор – Nano-500 от Allsheng. Это комбинированный прибор, который позволяет измерять концентрации и спектрофотометрическим, и флуориметрическим методами, то есть спектрофотометр и флуориметр «два в одном». Из особенностей этого прибора то, что в нем есть функции измерения концентрации белков колориметрическим методом, измерения оптической плотности при длине волны 600 нм и снятия спектров поглощения веществ. Длина оптического пути определяется автоматически в диапазоне 0.05-0.2 мм, диапазон детекции - от 200 до 800 нм. В качестве источника возбуждения в приборе используется импульсная ксеноновая лампа. Диапазон определения очень широкий: для двухцепочечной ДНК от 5 пкг до 15000 нг/мкл. В качестве детектора используется линейный ПЗС сенсор на 2048 элементов.

Все описанные приборы стали очень широко востребованными в период с 2019 по 2021 гг. во время пандемии. В частности, есть станции LifePad в одной из компаний, работающих в Казани, которые проводят в автоматическом режиме весь цикл пробоподготовки от идентификации образца до раскапывания уже готовой ПЦР плашки с образцами. Проблема состоит в том, что такая станция работает только с определенными реактивами и пластиком, которые поставляет эта же компания. Упомянутая станция применяется только для диагностики коронавируса, и с 2019 по 2021 гг. приобрела популярность: ее покупали многие больницы, поскольку она очень высокопроизводительная и позволяет за час исследовать 96 образцов и получить готовый результат. Дополнительные вопросы по оборудованию для выделения и оценки качества проб нуклеиновых кислот можно задать Глебу Миронову по телефону +7 (915)-482-48-97 или электронной почте gm@dia-m.ru.

Новость о вебинаре «Получение высококачественных ДНК и РНК: реагенты, наборы и оборудование – и новое, и старое» Ссылки на остальные части вебинара: Реагенты и наборы для выделения и очистки нуклеиновых кислот российского и зарубежного производства: что всегда есть на нашем складе; Привычные, незаметные, незаменимые: общелабораторное оборудование для молекулярно-биологической лаборатории