Нанопоровое секвенирование: от образца к интерпретации

Стратегии выделения нуклеиновых кислот для нанопорового секвенирования

В прошлой статье мы говорили о стратегиях подготовки библиотек для нанопорового секвенирования. Если стратегия экстракции определяет потенциал длины и чистоты нуклеиновых кислот, то выбор метода подготовки библиотеки определяет, насколько этот потенциал будет реализован в финальных данных. Ошибки, допущенные на этапе экстракции, не могут быть компенсированы на этапе библиотеки, а неправильный выбор библиотечного протокола способен нивелировать преимущества даже идеально выделенного препарата. Именно поэтому оба этапа должны рассматриваться как единая технологическая цепочка, где каждое решение — от метода лизиса до выбора ферментов для лигирования адаптеров — должно быть обосновано конечной биологической задачей: сборкой генома, анализом структурных вариантов или количественным профилированием метагенома.

Одним из ключевых ограничений, ограничивающих эффективность нанопорового секвенирования, является не пропускная способность чипов и не точность basecalling, а преаналитический этап — экстракция нуклеиновых кислот. В отличие от технологий коротких прочтений, где приоритетом выступает выход ДНК и отсутствие ингибиторов ферментов (лигазы, транспозазы), для нанопорового секвенирования критическими параметрами становятся целостность высокомолекулярной ДНК и минимальная фрагментация матричной РНК. Традиционные методы выделения, хорошо зарекомендовавшие себя в рутинной молекулярной биологии (фенольно-хлороформная экстракция, механический лизис с помощью шариков), зачастую приводят к деградации длинных молекул, снижению N50 (ключевой статистический показатель, который отражает среднюю длину полученных прочтений (ридов) или собранных фрагментов (контигов)) прочтений и забиванию нанопор неочищенными белковыми агрегатами.

Универсального протокола выделения нуклеиновых кислот не существует: стратегия, оптимальная для культивируемых клеток млекопитающих, оказывается малоприменимой при работе с микробиомами почв или фекалий, где требуется сочетание эффективного лизиса жёстких клеточных стенок с деликатным сохранением целостности ДНК. Для РНК-секвенирования на первое место выходит минимизация времени обработки и подавление РНКазной активности.

Перед началом эксперимента необходимо определить ключевые параметры, диктующие выбор стратегии выделения нуклеиновых кислот:

• требуемое количество ДНК или РНК, определяемое протоколом подготовки библиотеки и условиями хранения образца;
• тип биологического материала, для которого существует оптимальный метод лизиса и очистки, при этом некоторые образцы (почва, фекалии, растительные ткани) содержат естественные примеси (гуминовые кислоты, полисахариды, липиды, фенолы), способные ингибировать ферментативные реакции, а плотность клеточной стенки и степень сохранности ткани напрямую влияют на эффективность экстракции; и целевая длина фрагментов.

Ключевой принцип: целевая длина фрагментов определяет стратегию экстракции

Экспериментальная задача определяет, какая длина фрагментов ДНК или РНК необходима для успешного анализа. Выделяется три категории в зависимости от целевых длин.

• Короткие фрагменты (до 50 bp) — секвенирование образцов с естественной фрагментацией, например, внеклеточной ДНК (cfDNA).
• Длинные фрагменты (до 100 kp) — оптимальный баланс между выходом последовательностей и длиной прочтений; подходит для анализа структурных вариантов.
• Сверхдлинные фрагменты (100 kp и выше) — максимизация длины прочтений для задач сборки геномов de novo.

Этот выбор имеет прямое следствие для протокола выделения: сохранение сверхдлинных молекул требует минимальной механической нагрузки и отказа от агрессивного лизиса, тогда как для коротких фрагментов допустимы более жёсткие методы, а на первый план выходит эффективность удаления ингибиторов.

Хранение образцов перед экстракцией

Правильное хранение биоматериала до начала выделения нуклеиновых кислот — критический фактор, влияющий на качество и целостность конечного препарата.

Рис. 1. Зависимость показателя N50 от температуры хранения материла и растворителя, в котором сохраняется образец.

Общее правило — хранить образцы при температуре -80 °C как можно скорее после получения для сохранения целостности нуклеиновых кислот. Другие способы стабилизации образцов включают:

• Пробирки для крови.
• Карты FTA для капель крови.
• Пробирки VTM для сбора мазков.
• Целлюлозные фильтры для образцов воды или воздуха.
• Силикон для образцов почвы или кала, которые входят в состав спин-колонок для выделения.
• RNAlater, стабилизирующий РНК в разнообразных образцах тканей.

Сохранение выделенной ДНК

После экстракции ДНК требует правильного хранения и бережного обращения для сохранения целостности высокомолекулярных фрагментов.

Рис. 2. Зависимость параметра N50 от количества циклов оттаивания/замораживания.

Рекомендуется хранить выделенную ДНК при температуре -20 °C. Для сохранения длинных фрагментов:

• Используйте наконечники пипеток с широким отверстием (для предотвращения разрушения молекул).
• Перемешивать содержимое пробирок аккуратно, но тщательно, путём встряхивания (flicking) — без использования вортекса и многократного пипетирования.

Факторы, которых следует избегать:

• Вихревого перемешивания (vortexing) или пипетирования.
• Ненужных циклов замораживания-оттаивания (оказывают существенное влияние на длину прочтений — каждый дополнительный цикл приводит к снижению показателя N50, что критично для задач, требующих сверхдлинных фрагментов).
• pH не менее 6 или не более 9.
• Высоких температур.
• Введение ДНКаз.

Сохранение выделенной РНК

РНК значительно более лабильна по сравнению с ДНК, поэтому требования к её хранению и обработке существенно выше. Для длительного хранения выделенной РНК рекомендуется температура -80 °C.

Рис. 3. Зависимость стабильности РНК при разных температурах и в разных растворителях.

Для сохранения целостности РНК:

• Используйте одноразовые пробирки, чтобы избежать попадания РНКаз.
• Убедитесь, что образцы, поверхности и материалы не содержат РНКаз.
• Храните образцы на льду.

Факторы, которых следует избегать:

• Ненужных циклов замораживания-оттаивания.
• pH не менее 6 или не более 9.
• Высоких температур.
• Резких перепадов температуры.

Методы экстракции ДНК: выбор протокола в зависимости от типа образца

Выбор метода выделения ДНК для нанопорового секвенирования определяется не только целевой длиной фрагментов, но и биологическими особенностями образца — типом клеточной стенки, наличием ингибиторов, степенью сохранности материала. Для рутинных образцов, таких как культивируемые клетки, кровь млекопитающих и ткани, доступны протоколы различной степени жёсткости. Для получения коротких и средних фрагментов подходят методы, не требующие дополнительной обработки, тогда как некоторые протоколы могут предусматривать этап контролируемой фрагментации. Для длинных и сверхдлинных фрагментов применяются более щадящие методы экстракции.

Для микроорганизмов и грибов, обладающих жёсткими клеточными стенками, требуются более агрессивные протоколы лизиса. Для грибов эффективны методы с применением цетилтриметиламмония бромида в сочетании с колоночной очисткой; для дрожжей — лизис на основе поливинилпирролидона и додецилсульфата натрия с последующей преципитацией; для бактерий — колоночные методы или методы с использованием магнитных частиц (Vazyme, TransGen Biotech, Yasen, MP Bio, Lumiprobe, diaGene). Ключевая проблема при работе с этими объектами — эффективное разрушение плотной клеточной стенки без чрезмерной фрагментации ДНК, при этом для бактерий выбор метода также зависит от типа клеточной стенки (грам-отрицательные/грам-положительные).

Микробиомы и образцы окружающей среды (почва, вода, фекалии) требуют особого подхода: здесь применяются протоколы на основе механического разрушения с использованием стеклянных или керамических шариков (bead beating) для экстракции ДНК всех присутствующих видов.

FFPE-образцы (формалин-фиксированная, парафинированная ткань) поскольку формалиновая фиксация вызывает поперечные сшивки нуклеиновых кислот и фрагментацию ДНК, поэтому необходим этап реверсии сшивок. Для кровяных пятен на фильтровальной бумаге рекомендуются методы с использованием магнитных частиц; для внеклеточной ДНК (cfDNA) — протоколы, оптимизированные для работы с низкими концентрациями и малыми объёмами элюции; для плазмидной ДНК — стандартные методы щелочного лизиса с последующей очисткой.

Методы экстракции РНК: выбор протокола в зависимости от типа образца

Выделение РНК предъявляет повышенные требования к чистоте и целостности транскриптов, поскольку РНК значительно более лабильна по сравнению с ДНК. При работе с кровью значительную долю РНК составляет глобиновая мРНК (до 70% у эритроцитов), которая не несёт информативной нагрузки для большинства транскриптомных исследований, поэтому её удаление критически повышает покрытие целевых транскриптов. Для клеточных культур широко применяется метод с использованием гуанидинтиоцианата и фенола — универсальный и эффективный, однако требующий осторожности из-за потенциального загрязнения РНК органическими остатками.

Для бактерий выбор метода определяется типом клеточной стенки: Грам-отрицательные бактерии требуют иных подходов к лизису по сравнению с Грам-положительными, обладающими более толстым пептидогликановым слоем. Дополнительные этапы обработки включают деплецию рибосомальной РНК (рРНК), которая составляет до 80–90% всей бактериальной РНК и подлежит обязательному удалению для обогащения информативных транскриптов, а также полиаденилирование, применяемое в протоколах прямого РНК-секвенирования для повышения эффективности лигирования адаптеров.

Растительные ткани содержат высокие концентрации полисахаридов и полифенолов, которые могут ингибировать последующие ферментативные реакции, поэтому методы экстракции должны предусматривать их эффективное удаление (Vazyme, diaGene). Ткани животных различаются по содержанию липидов и соединительной ткани, что требует оптимизированных протоколов для эффективного лизиса и очистки (Vazyme, diaGene).

Контроль качества экстракции ДНК и РНК. Проверка количества, качества и длины фрагментов

Контроль качества является обязательным этапом при работе с нуклеиновыми кислотами для нанопорового секвенирования и должен проводиться на всех стадиях — от оценки выделенного препарата до проверки готовой библиотеки. Первым параметром, подлежащим оценке, является количественный выход: для определения количества ДНК или РНК используется флуориметрический метод с применением высокочувствительных красителей, который позволяет точно измерить концентрацию нуклеиновых кислот даже в низкоконцентрированных образцах. Вторым критическим параметром выступает качество экстракции, оцениваемое с помощью спектрофотометрии на приборах Nanodrop, EzDrop: соотношения поглощения при длинах волн A260/280 и A260/230 позволяют выявить присутствие белковых, фенольных, углеводных или других органических примесей, которые могут ингибировать последующие ферментативные реакции. Третьим, и, пожалуй, наиболее важным для нанопорового секвенирования параметром является длина фрагментов: для её оценки применяются методы электрофоретического разделения, включая капиллярный электрофорез, которые позволяют визуализировать распределение длин фрагментов в препарате и подтвердить наличие высокомолекулярной ДНК или целостной РНК.

Рис. 4. Оценка качества ДНК в зависимости от присутствия белковых, фенольных, углеводных или других органических примесей, ингибирующие последующие ферментативные реакции.

Для РНК дополнительным и крайне важным критерием качества служит показатель RIN (RNA Integrity Number) — интегральный параметр, определяемый с помощью системы капиллярного электрофореза, например, Qsep (BiOptic, Тайвань). RIN оценивает степень деградации РНК на основе распределения электрофоретических фракций 18S и 28S рибосомальной РНК в образце: значения RIN варьируются от 1 (полностью деградированная РНК) до 10 (полностью интактная РНК). Для успешного РНК-секвенирования на нанопоровых платформах рекомендуется использовать образцы с высокими показателями RIN, поскольку деградированная РНК характеризуется укорочением транскриптов и снижением полноты покрытия генома.

Рис. 5. Зависимость данных секвенирования клеточных линий человека с разными значениями RIN: образцы с RIN 2,5 дают значительное смещение распределения длин прочтений в сторону коротких фрагментов, тогда как образцы с RIN 8,1 сохраняют полноразмерные транскрипты и обеспечивают максимальную информативность данных.

Комплексное применение всех перечисленных методов — флуориметрии для точной количественной оценки, спектрофотометрии для контроля чистоты, электрофореза для проверки фрагментарного состава, а для РНК — дополнительного определения RIN — обеспечивает надёжный контроль качества на всех этапах подготовки образца. Это позволяет своевременно выявить проблемы, оценить пригодность материала для последующего секвенирования и скорректировать протокол экстракции или очистки перед переходом к подготовке библиотеки, что в конечном итоге определяет успех всего эксперимента.

Представленный обзор демонстрирует, что успех нанопорового секвенирования начинается задолго до загрузки чипа и определяется совокупностью правильных решений на всех этапах работы с нуклеиновыми кислотами. Однако качественно выделенные нуклеиновые кислоты — лишь первый шаг. Следующий этап — подготовка секвенирующей библиотеки, где выбор протокола (лигазного или транспозазного) должен соответствовать свойствам препарата и конечной задаче. Затем следует непосредственно нанопоровое секвенирование и биоинформатический анализ, превращающий сырые сигналы в биологически значимую информацию: сборку геномов, выявление вариантов или таксономическую классификацию микробиомов. Только комплексный подход ко всем этапам гарантирует получение надёжных и интерпретируемых данных.

Специалисты компании готовы помочь на всех этапах подготовки и проведения нанопорового секвенирования. Мы предлагаем квалифицированную консультацию по подбору оптимальных наборов реактивов для выделения нуклеиновых кислот в зависимости от типа вашего образца — будь то культивируемые клетки, кровь, ткани, микробиомы, FFPE-образцы или внеклеточная ДНК. Наши эксперты помогут учесть все нюансы: от целевой длины фрагментов до особенностей клеточной стенки и наличия ингибиторов, чтобы вы могли выбрать наиболее эффективный и экономичный протокол. Кроме того, мы предоставляем полный спектр реагентов для подготовки библиотек, секвенирования на платформах Polyseq Biotech и последующего анализа данных.

См. также:

Выделение и очистка нуклеиновых кислот
Гель- и хемидокументирующие системы
Станции выделения НК и белков
Термостаты, термостаты-шейкеры твердотельные
Центрифуги "микро" (до 48x1,5 мл)

Ниже вы можете задать вопрос или оставить запрос в свободной форме: