Наборы предназначены для выделения геномной ДНК из зелёных частей растений. Параллельно с геномной ДНК растения происходит выделение геномной бактериальной и вирусной ДНК, что удобно при анализе инфицированности растения.
Очистка ДНК на микроколонках diaGene начинается с избирательного связывания ДНК с сорбентом в присутствии хаотропной соли с последующей отмывкой связанной ДНК от примесей и заканчивается элюцией чистого препарата ДНК.
Сорбент позволяет выделять до 15 мкг геномной ДНК.
Все реагенты хранятся при комнатной температуре (+15-25 °С).
Методика рассчитана на выделение ДНК из 100 мкл цельной крови, стабилизированной ЭДТА. Объём образца может варьировать от 50 до 200 мкл. При этом объёмы Буфера LBB, Протеиназы К и Раствора для сорбции должны быть изменены пропорционально.
Дополнительное оборудование и реагенты:
твердотельный термостат, желательно с функцией перемешивания;
микроцентрифуга для пробирок типа эппендорф ёмкостью 1,5-2 мл с максимальной скоростью центрифугирования не менее 13000 об/мин;
дозаторы переменного объёма и наконечники с фильтрами к ним;
стерильные пробирки типа эппендорф ёмкостью 1,5 мл, свободные от нуклеаз;
96% этанол;
буфер PBS (для выделения ДНК из лейкоцитарного осадка);
деионизованная автоклавированная вода или вода, свободная от нуклеаз.
Перед началом работы:
добавьте 96% этанол в Раствор для промывки 2 (42 мл для 50 выделений, 70 мл в каждый флакон для 250 выделений) и тщательно перемешайте;
растворите Протеиназу К в деионизованной воде (2 мг в 110 мкл, 10 мг в 520 мкл). Рекомендуется расфасовать раствор Протеиназы К на аликвоты по 20-50 мкл;
возможно выпадение осадка в Растворе для сорбции. Для растворения осадка перед использованием необходимо прогреть раствор в течение 5-10 минут при +55 °С. Не нагревать свыше +65 °С!
во избежание загрязнения образцов не рекомендуется сливать фильтрат через край. Для удаления фильтрата используйте автоматическую пипетку или аспиратор;
для перевода значения скорости центрифугирования из об/мин в g воспользуйтесь специальными таблицами.
Выделение геномной ДНК из цельной крови
К 100 мкл образца добавьте 100 мкл Лизис-буфера LBB, тщательно перемешайте.
Добавьте 2 мкл раствора Протеиназы К, тщательно перемешайте и инкубируйте в термостате с перемешивание при 350-400 об/мин при +56 °С 30 минут. Если термостат без перемешивания - периодически встряхивайте пробирки.
Добавьте 280 мкл Раствора для сорбции и перемешайте на вортексе.
Внесите в колонку 100 мкл Раствора для промывки 1 (это не обязательно, но повышает эффективность сорбции) и выделяемый образец (не более 550 мкл). Центрифугируйте 2 минуты при 10000g. Необходимо учитывать, что объём колонки составляет 650 мкл. Если объём образца превышает 650 мкл, последовательно нанести образец на колонку, удаляя каждый раз фильтрат из пробирки для сбора фильтрата.
Нанесите на фильтр колонки 300 мкл Раствора для промывки 1 и центрифугируйте 2 минуты при 10000g. Удалите фильтрат.
Повторите п. 5.
Нанесите на фильтр колонки 500 мкл Раствора для промывки 2 и центрифугируйте 1 минуту при 12500-13000g.. Удалите фильтрат.
Повторите п. 7.
Поместите микроколонку в ту же пробирку и центрифугируйте 1 минуту при 12500-13000g для удаления остатков раствора.
Поместите микроколонку в новую 1,5 мл пробирку. Нанесите в центр мембраны 50 мкл деионизованной воды и подождите 1-3 минуты. Минимальный объём воды для элюции — 30 мкл, максимальный — 100 мкл. При элюции 30 мкл достигается максимальная концентрация ДНК, при элюции 100 мкл — максимальный выход.
Элюируйте ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 12500-13000g. В среднем из 100 мкл человеческой крови выделяется от 0,5 до 2 мкг геномной ДНК. Ёмкость колонки составляет до 20 мкг ДНК. Для получения большего количества геномной ДНК рекомендуется выделение из лейкоцитарного осадка.
Выделение геномной ДНК из лейкоцитов
Заморозьте образцы при -20 °С для лизиса эритроцитов.
После оттаивания центрифугируйте образцы при 1500 g в течение 10 минут.
Удалите супернатант, по возможности не затрагивая осадок.
Ресуспендируйте осадок в 200 мкл буфера PBS. Добавьте 200 мкл Буфера LBB и 8 мкл Раствора протеиназы К. Инкубируйте образцы при +56°С в течение 30 минут в термостате с перемешиванием либо периодически встряхивая пробирки.
Добавьте к образцам 560 мкл Раствора для сорбции, перемешайте на вортексе.
Внесите в колонку 600 мкл выделяемого образца. Центрифугируйте 3 минуты при 10000 g. Необходимо учитывать, что объём колонки составляет 650 мкл. Удалите фильтрат и внесите в колонку оставшуюся часть образца. Центрифугируйте 3 минуты при 10000 g. Удалите фильтрат. Если выделение производится из осадка с объёма крови более 500 мкл — то лизат может быть вязким и плохо фильтрующимся. В этом случае увеличьте время центрифугирования до 5 минут. Дальнейшее выделение ДНК производится по методике для цельной крови, описанной выше, начиная с п.5.
Особенности хранения и срок годности:
Все реактивы (кроме протеиназы К) и колонки хранить при комнатной температуре (+15...25 °С);
протеиназу К хранить при +2...8 °С, после растворения — при -20 °С;
после использования пакет с колонками рекомендуется плотно закрывать;
Набор предназначен для выделения до 25 мкг плазмидной ДНК длиной до 20 т.п.н. из 3-5 мл бактериальной культуры. Очистка ДНК на колонках diaGene происходит за счёт избирательного связывания ДНК с сорбентом в присутствии хаотропной соли с последующей отмывкой связанной ДНК от примесей и заканчивается элюцией чистого препарата ДНК.
Выход ДНК зависит от ряда факторов: копийности плазмиды, условий роста, объёма культуры и т.д.
Не рекомендуется использовать для выделения плазмид длиной свыше 50 тысяч пар нуклеотидов, а также для получения препарата плазмидной ДНК для трансфекции эукариотических клеток.
Срок годности и особенности хранения:
Все реактивы (кроме РНКазы А) и колонки хранить при комнатной температуре (+15...25 °С).
РНКазу А хранить при -20 °С.
Буфер R после добавления РНКазы хранить при +2...8°С.
После использования пакет с колонками рекомендуется плотно закрывать
Срок годности: 12 месяцев с даты изготовления.
При транспортировке особые условия не требуются.
Дополнительное оборудование и реагенты:
Микроцентрифуга для пробирок типа эппендорф ёмкостью 1,5-2 мл с максимальной скоростью центрифугирования не менее 12500 g;
дозаторы переменного объёма и наконечники с фильтрами к ним;
стерильные пробирки типа эппендорф ёмкостью 1,5 мл, свободные от нуклеаз;
96 % этанол;
деионизованная автоклавированная вода или вода, свободная от нуклеаз.
Выделение плазмидной ДНК из бактерий
Перед началом работы добавьте 8 мл 96 % этанола в Буфер W, а также РНКазу А в Буфер R. При нерегулярном использовании набора рекомендуется отбирать нужное количество Буфера R и добавлять к нему 1/100 объёма РНКазы А. Для перевода значения скорости центрифугирования из об/мин в g воспользуйтесь специальными таблицами.
Осадите бактериальные клетки из 3-5 мл культуры в 1,5 мл пробирке центрифугированием при 1000g в течение 10 минут.
Тщательно ресуспендируйте клетки в 200 мкл Буфера R с РНКазой.
Добавьте 200 мкл Буфера L и осторожно перемешайте. Лизат должен стать прозрачным и вязким. Не перемешивать на вортексе и не встряхивать, так как это может привести к разрыву геномной ДНК и загрязнению конечного препарата.
Добавьте 200 мкл буфера N и тщательно перемешайте до образования белого осадка.
Центрифугируйте 10 минут при 10000 g.
Поместите микроколонку в 2 мл пробирку для сбора фильтрата. Перенесите супернатант в микроколонку и центрифугируйте 1 мин при 12500-13000g.
Вылейте фильтрат, поместите микроколонку в ту же пробирку и нанесите 650 мкл Буфера W. Центрифугируйте 1 мин при 12500-13000g.
Вылейте фильтрат, поместите микроколонку в ту же пробирку и центрифугируйте 1 мин при 13000 об/мин, чтобы удалить остатки Буфера W.
Поместите микроколонку в новую 1,5 мл пробирку. Нанесите в центр мембраны 50-100 мкл Буфера Е и подождите 1 мин. Вместо буфера Е для элюции также можно использовать воду, свободную от нуклеаз, или деионизованную автоклавированную воду. Минимальный объём элюента – 30 мкл, максимальный – 150 мкл. При элюции 30 мкл достигается максимальная концентрация ДНК, при элюции 150 мкл – максимальный выход.
Элюируйте ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 12500-13000g.
Возможные проблемы и методы их решения
Проблема
Причина
Решение
Мало ДНК на выходе
Слишком много бактерий
Уменьшить объём культуры. Рекомендуется начинать с 3 мл культуры
Неполный лизис
Ресуспендировать осадок более тщательно до полного разрушения бактериальных сгустков
Неполная нейтрализация после лизиса
Тщательно перемешивать после добавления Буфера N
Перед стадией элюции не полностью удалены остатки Буфера W
Обратить внимание на пункт o дополнительном центрифугировании
Загрязнение геномной ДНК
Слишком интенсивное перемешивание после добавления Буфера N
Набор предназначен для очистки ДНК из реакционных смесей после ПЦР, лигирования, рестрикции и т.д. Очистка ДНК происходит за счёт избирательного связывания с сорбентом колонок на основе диоксида кремния. Фрагменты двцхцепочечной ДНК длиной свыше 50 п.н. сорбируются на мембрану колонки в присутствии хаотропного агента, а примеси (нуклеотидтрифосфаты, одноцепочечные олигонуклеотиды, соли и т.д.) оказываются в проскоке. Чистая ДНК элюируется буфером или деионизованной водой.
Ёмкость колонки составляет до 25 мкг ДНК, но зависит от состава наносимого на колонку препарата и от длины фрагментов ДНК.
Буфер Y содержит в своем составе индикатор кислотности. Эффективность сорбции ДНК зависит от рН (связывание ДНК с сорбентом происходит при рН < 7.5). При оптимальном для сорбции рН индикатор имеет желтый цвет. Если после добавления к образцу Буфера Y, цвет индикатора отличается от желтого, к смеси необходимо добавить 10 мкл 3М ацетата Na (pH 5.0).
Срок годности и особенности хранения:
Все реактивы и колонки хранить при комнатной температуре (+15...25 °С).
После использования пакет с колонками рекомендуется плотно закрывать.
Срок годности: 12 месяцев с даты изготовления.
При транспортировке особые условия не требуются.
Дополнительное оборудование и реагенты:
Микроцентрифуга для пробирок типа эппендорф ёмкостью 1.5-2 мл с максимальной скоростью центрифугирования не менее 13000 об/мин (11000g).
Дозаторы переменного объёма и наконечники с фильтрами к ним.
Стерильные пробирки типа эппендорф ёмкостью 1.5 мл, свободные от нуклеаз.
96% этанол.
Изопропанол.
3М раствор ацетата натрия с рН 5.0
Опционально – деионизованная автоклавированная вода или вода, свободная от нуклеаз.
Очистка ДНК из реакционных смесей
Перед началом работы:
добавьте изопропанол в Буфер Y (12 мл для набора на 50 выделений, 60 мл для набора на 250 выделений). Тщательно перемешайте;
добавьте 96 % этанол в Буфер W (32 мл для набора на 50 выделений, 60 мл в каждый флакон для набора на 250 выделений). Тщательно перемешайте.
К одному объёму реакционной смеси добавьте 5 объёмов Буфера Y (например, к 100 мл реакционной смеси надо добавить 500 мкл Буфера Y). Тщательно перемешайте.
Поместите колонку в пробирку для сбора фильтрата. Перенесите в колонку полученный раствор и центрифугируйте 1 минуту при 13000 об/мин. Необходимо учитывать, что объём колонки составляет 650 мкл. Если объём образца превышает 650 мкл, последовательно нанесите образец на колонку, удаляя каждый раз жидкость из пробирки для сбора фильтрата.
Нанесите на колонку 650 мкл Буфера W и центрифугируйте 1 мин при 6000 об/мин. Удалите фильтрат.
Центрифугируйте пустую колонку 1 минуту при 13000 об/мин для удаления остатков Буфера W. Поместите микроколонку в новую 1,5 мл пробирку. Нанесите в центр мембраны 30-100 мкл Буфера Е и подождите 1 мин. Можно также использовать для элюции воду, свободную от нуклеаз или деионизированную автоклавированную воду. Минимальный объём элюента – 30 мкл, рекомендуемый – 50 мкл. При элюции 30 мкл достигается максимальная концентрация ДНК, но возможны потери.
Элюируйте ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 13000 об/мин.
Возможные проблемы и методы их решения
Проблема
Возможная причина
Решение
Мало ДНК на выходе
рН раствора не оптимален для связывания ДНК с сорбентом
Обратить внимание на цвет индикатора. Если он отличается от жёлтого - добавить 10 мкл 3М ацетата натрия, рН 5.0
Перед стадией элюции не полностью удалены остатки Буфера W
Обратить внимание на пункт о дополнительном центрифугировании
Набор предназначен для элюции и очистки фрагментов ДНК из легкоплавкого агарозного геля после электрофоретического разделения. С помощью набора можно элюировать ДНК из ТАЕ- или ТВЕ-геля, процесс прост и занимает не более 15-20 минут. После отмывки от примесей чистый препарат ДНК элюируется с колонки.
Полученный препарат ДНК может использоваться для рестриктазного расщепления, лигирования, секвенирования и др.
Ёмкость колонки diaGene составляет до 25 мкг ДНК.
Буфер для сорбции М содержит в своем составе индикатор кислотности. Эффективность сорбции ДНК зависит от рН (связывание ДНК с сорбентом происходит при рН < 7,5). При оптимальном для сорбции рН индикатор имеет желтый цвет. Если после добавления к образцу
буфера М цвет индикатора отличается от желтого, к смеси необходимо добавить 10 мкл 3М ацетата Na (pH 5,0).
Состав набора:
50 выделений
Кат.№ 3326.0050
250 выделений
Кат.№ 3326.0250
Буфер М
35 мл
2 x 75 мл
Буфер W
8 мл
3 х 15 мл
Буфер Е
5 мл
25 мл
Микроколонки
50 шт.
5 x 50 шт.
2 мл пробирки для сбора фильтрата
50 шт.
5 x 50 шт.
Срок годности и особенности хранения:
все реактивы и колонки хранить при комнатной температуре (+15...25 °С);
после использования пакет с колонками рекомендуется плотно закрывать;
срок годности: 12 месяцев с даты изготовления;
при транспортировке особые условия не требуются.
Дополнительное оборудование и реагенты:
твердотельный термостат, желательно с функцией перемешивания;
микроцентрифуга для пробирок типа эппендорф ёмкостью 1,5-2 мл с максимальной скоростью центрифугирования не менее 13000 об/мин;
дозаторы переменного объёма и наконечники с фильтрами к ним;
стерильные пробирки типа эппендорф ёмкостью 1,5 мл, свободные от нуклеаз;
96% этанол;
3М раствор ацетата натрия рН 5,0;
опционально — деионизованная автоклавированная вода или вода, свободная от нуклеаз.
Элюция ДНК из агарозного геля
Перед началом работы добавьте 96% этанол в Буфер W (32 мл для 50 выделений, 60 мл в каждый флакон для 250 выделений), тщательно перемешайте.
Взвесьте фрагмент геля в 1,5 мл пробирке и добавьте Буфер М из расчёта 300 мкл Буфера М на 100 мг геля.
Инкубируйте при 50 °С, периодически перемешивая, до полного растворения геля (не более 10 мин).
Поместите микроколонку в 2 мл пробирку для сбора фильтрата. Перенесите полученный раствор (но не более 650 мкл) в микроколонку и центрифугируйте 1 мин при 13000 об/мин. Если объем раствора превышает объем колонки (650 мкл), его можно наносить последовательно, удаляя всякий раз фильтрат.
Вылейте фильтрат, поместите микроколонку в ту же пробирку и нанесите 650 мкл Буфера W. Центрифугируйте 1 мин при 13000 об/мин.
Вылейте фильтрат, поместите микроколонку в ту же пробирку и центрифугируйте 1 мин при 13000 об/мин, чтобы удалить остатки Буфера W.
Поместите микроколонку в новую 1,5 мл пробирку. Нанесите в центр мембраны 30-50 мкл Буфера Е и подождите 1 мин. Элюируйте ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 13000 об/мин. Также для элюции можно использовать воду, свободную от нуклеаз. Минимальный объём элюции — 30 мкл.
Возможные проблемы и методы их решения
Проблема
Причина
Решение
Мало ДНК на выходе
рН раствора не оптимален для связывания ДНК с сорбентом
Обратить внимание на цвет индикатора. Если он отличается от желтого, добавить 10 мкл 3М ацетата Na (рН 5,0)
Перед стадией элюции не полностью удалены остатки Буфера W
Обратить внимание на пункт o дополнительном центрифугировании
Гель растворен не полностью
Инкубировать при 50 °C 10 минут, перемешивая каждые 2-3 минуты
