Экстра-микс RT-qPCR SYBR Blue предназначен для проведения обратной транскрипции и количественной ПЦР в режиме реального времени одношаговым методом с использованием флуоресцентного красителя SYBR Green I. Кроме собственно
экстра-микса RT-qPCR, в состав набора входят
2-кратный буфер RT-qPCR SYBR Blue и вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Буфер оптимизирован для протекания как обратной транскрипции, так и ПЦР (в том числе на сложных и GC-богатых матрицах) и содержит все необходимые компоненты (за исключением РНК-матрицы и праймеров), а также интеркалирующий краситель SYBR Green I. Хранение буфера при комнатной температуре в течение 2 дней не снижает эффективность реакции. Инертный краситель в составе Экстра-микса окрашивает его в голубой цвет (максимум поглощения – 615 нм) и облегчает контроль за раскапыванием смеси при использовании многолуночных планшетов.
Экстра-микс RT-qPCR представляет собой смесь обратной транскриптазы
MMLV-RH и
HS-Taq ДНК-полимеразы с "горячим" стартом в оптимальном соотношении для протекания обеих реакций.
MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н.
MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.
HS-Taq ДНК-полимераза представляет собой рекомбинантную
Taq ДНК-полимеразу, инактивированную специфическими моноклональными антителами.
HS-Taq ДНК-полимераза неактивна при температуре ниже +70
оС. Для её активации необходим прогрев реакционной смеси при +95°С в течение 5 мин. Рекомбинантная
HS-Taq ДНК-полимераза обладает 5´-3´ ДНК-зависимой полимеразной активностью и 5’-3’ экзонуклеазной активностью нативной
Taq ДНК-полимеразы из
Thermus aquaticus. Скорость продвижения
Taq ДНК-полимеразы зависит от сложности ДНК-матрицы и составляет примерно 1 т.п.н./мин. Рекомбинантная
HS-Taq ДНК-полимераза идеально подходит для стандартной ПЦР с матрицы до 5 т.п.н.; обладает способностью присоединять аденин к 3’-концу синтезируемой цепи, поэтому продукты ПЦР могут использоваться для ТА-клонирования.
SYBR Green I - флуоресцентный интеркалирующий краситель для количественной и качественной детекции продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени. SYBR Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов (в том числе в режиме реального времени). В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР-продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал. Максимумы поглощения и испускания SYBR Green I - 494 нм и 521 нм соответственно, что позволяет использовать его со всеми известными на сегодняшний день амплификаторами для проведения ПЦР в режиме реального времени.
Состав набора
|
Кат. №
|
Кол-во реакций по 50 мкл
|
Экстра-микс RT-qPCR
|
Буфер RT-qPCR SYBR Blue(2x)
|
ДМСО
|
Вода, обработанная ДЭПК
|
|
1969.0040
|
40
|
80 мкл
|
2 х 0,5 мл
|
0,5 мл
|
2 х 0,5 мл
|
|
1969.0200
|
200
|
2 х 200 мкл
|
4 х 1,25 мл
|
0,5 мл
|
3 х 1,8 мл
|
Состав Экстра-микса RT-qPCR:
- 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);
- 100 мM NaCl;
- MMLV-RH обратная транскриптаза;
- HS-Taq ДНК-полимераза;
- 1 мМ ЭДТА;
- 5 мМ дитиотреитол;
- 50% (v/v) глицерин;
- 0,1% (v/v) NP-40.
Состав буфера RT-qPCR SYBR Blue (2х):
- 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);
- 150 мM КCl;
- 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
- 10 мМ MgCl₂;
- 8 мМ дитиотреитол;
- интеркалирующий краситель SYBR Green I;
- инертный краситель;
- стабилизаторы и усилители активности ферментов.
Преимущества использования экстра-микса:
- Высокая специфичность.
- Высокая чувствительность.
- Простота и удобство в использовании.
- Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.
- Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).
- Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов.
Область применения:
- Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.
- Количественный анализ РНК, в том числе анализ экспрессии генов.
Ограничения к использованию:
- Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 тыс. п.н.
- Не рекомендуется использовать для ПЦР с флуоресцентными зондами.
Срок хранения и транспортировка:
9 месяцев при -20 °С; не более 30 циклов замораживания- азмораживания экстра-микса RT-qPCR.
