Набор для секвенирования кДНК со стадией ПЦР
PCR-cDNA Sequencing Kit предназначен для секвенирования РНК через стадию синтеза кДНК с последующей ПЦР. С помощью набора
PCR-cDNA Sequencing Kit можно:
- работать с ограниченным количеством стартового материала;
- оптимизировать ход эксперимента для получения максимальной производительности;
- исследовать дифференциальную экспрессию генов;
- характеризовать транскрипционные изоформы, варианты с альтернативным спласингом и фьюжн-транскрипты;
- секвенировать полноразмерные кДНК и анализировать их количество.
В состав набора входит
Pro Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотек в ячейку, совместимый с ячейками для
PromethION
Особенности набора:
время пробоподготовки
|
от 165 минут
|
требуемое количество ДНК
|
1 нг полиА + РНК или 50 нг суммарной РНК
|
необходимость обратной транскрипции
|
да
|
необходимость ПЦР
|
да
|
длина рида
|
равна длине полных транскриптов
|
производительность
|
3 гигабазы и более за 6 часов, до 8 гигабаз и более за 48 часов
|
число ридов
|
7-12 миллионов и более полноразмерных кДНК
|
мультиплексирование
|
с PCR Barcoding Expansion Pack (SQK-PBK004)
|
совместимые протоколы
|
cDNA-PCR sequencing
|
количество библиотек
|
6
|
совместимость с проточными ячейками
|
FLO-MIN106D; FLO-PRO002 (PromethION)
|
Набор рассчитан на работу с минимальным количеством поли-А+ РНК, для получения библиотеки достаточно всего 1 нг. В случае невозможности выделения полиА+-фракции допустимо использование суммарной РНК (рекомендуется не менее 50 нг), но в этом случае требуется оптимизация пробоподготовки.
Пробоподготовка заключается в синтезе комплементарной цепи кДНК с помощью обратной транскрипции. Обогащение библиотеки полноразмерными копиями происходит за счёт переключения цепей при обратной транскрипции (strand-switching). Затем происходит синтез двухцепочечной кДНК с помощью ПЦР, в реакции используются специфические праймеры для последующего безлигазного присоединения сиквенсных адаптеров.
При работе с
PCR-cDNA Sequencing Kit предусмотрена возможность мультиплексирования с помощью набора
PCR Barcoding Expansion (SQK-PBK004). В одну библиотеку может быть загружено до 12 образцов кДНК.
Дополнительные расходные материалы и реактивы:
- магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
- мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2x (New England Biolabs M0287);
- 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 30108051);
- 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
- вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
- свежеприготовленный 70% этанол;
- 10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0191);
- обратная транскриптаза Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific EP0751);
- ингибитор РНКаз RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific 10777019).
Дополнительное оборудование:
- настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
- вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
- магнитный штатив (Диаэм 3336);
- ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
- амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
- набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0.5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
- наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
- термоконтейнер со льдом;
- таймер (например, TR118OS);
- охлаждающий штатив для пробирок на 0,2 мл (например, Eppendorf 3881000031).
Опционально:
- флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
- система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
- наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).