ДНК-амплификаторы для изотермической ПЦР

ДНК-амплификаторы для изотермической амплификации

Изотермическая амплификация методами LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) и RT-LAMP (тот же LAMP, но включающий обратную транскрипцию и используемый для амплификации РНК), а также рядом других методов — это варианты быстрого метода амплификации нуклеиновых кислот, отличающегося высокими специфичностью, производительностью и низкой чувствительностью к контаминантам.

Вместо смены температуры для каждой стадии амплификации метод предусматривает проведение всего процесса при единой постоянной температуре в диапазоне 60-65 °C. Использование ДНК-полимеразы с высокой вытесняющей активностью, например ДНК-полимераза Lamp, Диаэм обеспечивает при амплификации увеличение количества ДНК-мишени на 9 и даже 10 порядков в течение 15-60 минут.

Изотермические амплификаторы дают возможность специфически детектировать ПЦР-продукты в режиме реального времени и получать результат формата «позитив»/«негатив» без количественной оценки содержания нуклеиновой кислоты. Количественное определение в данном случае затруднительно в связи с лавинообразным накоплением продуктов амплификации.

С их использованием можно установить наличие или отсутствие в пробе определенных вирусов, бактерий и простейших. Есть опыт применения в онкологических исследованиях для быстрого выявления в пробах специфических опухолевых клеток. В растениеводстве методы изотермической амплификации используют для экспресс-диагностики различных фитопатогенов в полевых условиях.

Метод подразумевает использование 4-6 праймеров, нацеленных максимум на 8 областей одного небольшого сегмента генома. При дизайне таких праймеров существует много ограничений, и в разработке соответствующих наборов используется специализированное программное обеспечение — бесплатное или коммерческое. Но в целом их использование дает высокую специфичность и снижает риск ложноположительных результатов.

А чувствительность, к примеру, метода RT-LAMP может в 10 раз превышать этот показатель для других ПЦР-методов, что доказано экспериментально.

Как правило, амплификаторы для изотермической амплификации — это компактные приборы, в том числе с автономным электропитанием.

На российском рынке приборов для молекулярной биологии в настоящее время доступны модели амплификаторов отечественного производства. Помимо более доступной цены это дает защиту от риска несвоевременной поставки оборудования и расширяет возможности в плане сервисной поддержки.

При выборе изотермического амплификатора нужно учесть комплекс его характеристик, ориентируясь на пропускную способность и задачи лаборатории пользователя.

Сфера применения прибора

На рынке появились тест-системы методом изотермической амплификации под решение узких задач, например, определения 1-2 целевых патогенов (COVID-19, боррелиоз и т.д.). Обычно производители указывают на возможность разработки альтернативных тест-систем по требованиям заказчика, но при выборе следует узнать, с какими реактивами и наборами может использоваться тот или иной прибор.

Формат термоблока

Особо компактные модели могут иметь термоблок всего на две пробирки; в то же время на российском рынке доступны модели, на которых можно работать одновременно с четырьмя или восемью пробами по 0,2 мл, как в случае амплификатора LAMPIX 8. Важно также знать, с каким типом пробирок работает то или иное устройство: с индивидуальными пробирками, стрипами, каков их объем.

Следует уточнить наличие подогреваемой крышки термоблока: в простейших приборах может использоваться крышка без подогрева.

Значение имеет диапазон регулировки температуры термоблока: несмотря на то, что общепринятым считается проведение изотермической амплификации при температуре 60-65 °C, ряд методик может подразумевать другие температурные условия. Справочные материалы указывают на температурный оптимум для различных процессов в диапазоне от 37 до 65 °C. Отдельные модели изотермических амплификаторов поддерживают диапазон температуры от 40 и даже от 37 до 75 °C.

Имеет значение также точность поддержания температуры (±0,5 °C в большинстве предлагаемых приборов).

Специфика детекции продуктов реакции

В большинстве моделей для изотермической амплификации используется детекция результатов в реальном времени с помощью измерения интенсивности флуоресценции по одному (реже — двум и более) каналам.

Следует также обратить внимание на совместимость прибора с красителями FAM, SYBR Green, EvaGreen — всеми или только отдельными из них.

Чувствительность

Среди приборов для обеспечения этого процесса есть такие, которые позволяют детектировать количество ДНК/РНК от 50 копий (но некоторые модели требуют не менее 100 копий).

Интерфейсы для подключения к ПК/ноутбуку и требования к ОС

В большинстве моделей подключение к компьютеру реализовано через порт USB (microUSB, type C) и/или Bluetooth, реже Wi-Fi.
Программное обеспечение для управления и анализа результатов может работать под Windows 7-10 (или только под Win10) или Android. Следует обратить внимание также на характеристики ПК или ноутбука, при которых возможно использовать ПО прибора.
Некоторые модели изотермических амплификаторов снабжены собственным дисплеем, что позволяет использовать устройство автономно, без подключения к ПК.

Подключение к источнику питания

Устройства для изотермической амплификации могут быть снабжены внешним блоком питания и/или переносным аккумулятором. Наличие автономного источника питания обязательно, если планируется использовать прибор вне лаборатории.