Конфокальный микроскоп

25.10.2021
Конфокальный микроскоп

Через зрение человек получает до девяносто процентов информации об окружающем мире. Поэтому, когда взгляд человека проникает в новую, прежде скрытую область, это всегда приводит к скачкообразному развитию знаний человека о вселенной.

Секрет Левенгука

Традиционно историю использования микроскопов связывают с именем Антони ван Левенгука. Именно он заложил основы микроскопии. Признания его вклада в развитие науки так велико, что все девять ныне сохранившихся микроскопов его работы считаются народным достоянием. Поэтому долгое время не удавалось раскрыть секрет изготовления крошечных, но очень мощных линз. Однако, не так давно учёные использовали метод, не приводящий к разрушению структуры стекла, и выяснили, что скорее всего Левенгук оплавлял тонкую стеклянную проволоку, пока не получится шарик, а после шлифовал его. Считается, что максимальная оптическая сила, которой он смог добиться составляла пятисот кратное увеличение. Однако, из сохранившихся на данный момент микроскопов самый сильный не доходит и до трехсот кратной величины. Впрочем, и этот показатель очень впечатляет, учитывая, что Левенгук создавал однолинзовые микроскопы.

С тех пор наука шагнула далеко вперёд, конструкция микроскопов стала гораздо сложнее, а их использование, наоборот, легче. Но основные принципы работы прямых микроскопов остались прежними.

Микроскоп Левенгука

Микроскоп очень похож на глаз. Правда, скорее не человеческий, а глаз осьминога, в котором резкость изображения наводится за счёт перемещения хрусталика вдоль оптической оси, а не изменения его кривизны.

Свет попадает на изучаемый объект и уже тут начинаются нюансы. Дело в том, что осветить объект можно по-разному. Наверное, все помнят школьные опыты с луковой кожицей. В этом случае свет, обычно отражённый зеркальцем, проходил одинарный слой клеток насквозь. Такой метод микроскопии называется светлопольным. Поскольку световой поток не только проходит сквозь изучаемый предмет, но и заливает всё окружающее пространство. Из-за этого поле зрения в объективе выглядит как бело-жёлтый кружок с исследуемым образцом, напоминающим скопление теней.

Различия методов микроскопии

Конечно, для того чтобы свет попал в объектив, изучаемый образец должен быть прозрачным. Если речь об изучении воды с кишащими в ней микроорганизмами, чем и стал знаменит Левенгук, проблем с прозрачностью не возникает. Но если требуется изучить твёрдый образец, начинаются сложности. Самый простой способ получить прозрачный препарат в подобных условиях ‒ это сделать срез настолько тонкий, что свет будет проходить сквозь него. Но создание такого препарата трудоёмкий процесс. И он, увы, не подходит для прижизненного изучения организмов.

Противоположность светлопольного ‒ темнопольный метод. Как не сложно понять, при его использовании в поле зрения виден чёрный круг, в котором присутствует светлый объект исследования. В этом методе свет на предметное стекло направляют сверху, и потому исследователь видит объект исследования в отражённом свете. Так же, как это происходит при обычном зрении. Поэтому такой метод подходит для непрозрачных образцов, у которых становится возможно изучить детали поверхности. Однако, внутренние структуры при таком подходе недоступны наблюдению.

Кровь под микроскопом

Чтобы справиться с ограничениями этих двух методов, было разработано ещё несколько подходов к микроскопии. Метод фазового контраста позволил преодолеть сложность в изучении очень блеклых образцов. Свет в специальной насадке разделяется на два пучка, которые гасят друг друга за счёт интерференции. Но этого не происходит с теми лучами фотонов, которые уже изменили свою фазу, пройдя сквозь малоконтрастную прозрачную, или отразившись от почти не рельефной непрозрачной оказавшейся в предметном поле детали. А значит тот свет, что касался изучаемого объекта, не будет гаситься. И изображение становится гораздо более чётким.

Оптические свойства специально измененного дополнительным устройством света использует и поляризационная микроскопия. Тут всё несколько проще. Некоторые вещества, обладают свойством анизотропности. То есть, их структура различна по разным направлениям. В данном случае имеется в виду оптическая анизотропия. Это значит, что свет, поляризованный в разных плоскостях, по-разному отражается от вещества. Чаще всего таким свойством обладают сложные кристаллы и органические волокна. Именно создание поляризованного света, и его считывание после взаимодействия с образцом и составляет суть дополнительного устройства, превращающего обычную микроскопию в поляризационную.

Особенности флуоресцентной микроскопии

Одним из наиболее быстро развивающихся сегодня видов можно считать флуоресцентную микроскопию. Суть его в том, что в самом объекте исследования есть что-то, способное светиться. Конечно, чтобы заметить это свечение, сам микроскоп зачастую должен тоже быть необычным. Скорее всего, у него должна быть возможность ультрафиолетовой подсветки предметной области. А для снижения оптических искажений применяют иммерсионную микроскопию. То есть, между предметным стеклом и объективом помещают капельку масла. В неё погружается окуляр, и оптические свойства масла делают картинку более чёткой и яркой.

Клетка под микроскопом

Причина, по которой сегодня так широко распространена флюоресцентная микроскопия ‒ активное использование GFP, зелёного флуоресцентного белка. Это особый белок, выделенный из североамериканской медузы. В самой медузе он входит в состав сложного биолюминесцентного комплекса, и немного смещает оттенок света, который медузы испускают. Однако оказалось, что при добавлении гена этого белка в другие организмы, он достаточно легко принимает активную форму, и может испускать зеленоватый свет при облучении ультрафиолетом. Это позволило запустить множество исследований, демонстрирующих, какая часть генома активна в тех или иных условиях у разных организмов. В случае, когда этот белок синтезируется и накапливается в клетке, он начинает светиться. И более того, он показывает, в какой именно части клетки происходит активация тех или иных генов.

Впрочем, это не единственный метод флуоресцентной микроскопии. Раньше для этого использовали специальные краски на основе антител к тем или иным веществам. Попадая в клетку, такая краска прочно связывалась со своей целью, и также могла свечением указать на расположение в клетке вещества-мишени. Так, например, работал один из методов определения срока гриппозной инфекции по мазкам из носа. После окраски достаточно было взглянуть, находится ли вирус в ядре или цитоплазме клетки.

Конечно, все эти дополнения уже выводят подобные микроскопы из категории простых устройств. Сегодняшний исследовательский микроскоп может оказаться невероятно сложным устройством, собственно оптическая часть которого занимает лишь малую часть. Ну и кроме того, помимо простых световых микроскопов, существуют и те, что используют немного иные принципы. Электронный микроскоп использует поток электронов вместо света. Принцип действия сканирующего конфокального микроскопа чем-то напоминает технологию фазового контраста, но вместо обычного света в нём используется лазер.

Представить современную науку без микроскопии уже невозможно. Одна из самых старых технологий на сегодняшний день изменилась очень сильно. Но всё же, в работу современных световых микроскопов положены те же принципы, которые уже больше трёхсот лет назад использовал Левенгук. Так на обычном исследовательском приборе прослеживается связь поколений.


Возврат к списку

Ваш заказ будет обработан
в ближайшее время.
Мы пришлем уведомление, как только все будет готово. Спасибо!