Генетический анализ: доступные инструменты для молекулярной генетики. Биоанализаторы Qsep: предварительный анализ нуклеиновых кислот и не только (транскрибация видеозаписи вебинара лектория Диаэм сезона 2022)

26.04.2023

Содержание статьи:

Эта публикация отражает содержание первой части вебинара «Генетический анализ: доступные инструменты для молекулярной генетики», состоявшегося 20 октября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».

Специалист «Диаэм» в области молекулярной генетики и смежных дисциплин Николай Байбаев рассказал о новинках рынка приборов и материалов для молекулярной биологии и генетики и о том, чем можно заменить в актуальных быстро меняющихся условиях продукцию, с которой российские исследователи привыкли работать раньше. Этот вебинар автор посвятил в основном системам электрофореза и секвенирования NGS. В первой части «Биоанализаторы Qsep: предварительный анализ нуклеиновых кислот и не только» Николай остановился на семействе приборов Qsep.

Задачи, решаемые с помощью биоанализаторов Qsep

В первую очередь эти приборы применяются для фрагментного анализа нуклеиновых кислот. Для чего это нужно? Такие задачи можно разделить на две группы.Биоанализы Qsep - предварительный анализ нуклеиновых кислот и не только

К первой группе – предварительному анализу нуклеиновых кислот – относятся вспомогательные методы, необходимые для оценки чаще всего нуклеиновых кислот перед другими работами. В числе таких можно назвать

  • скрининг ПЦР (например, если нужно провести оценку перед тем же сэнгеровским секвенированием или NGS),
  • количественный и качественный анализ библиотек для секвенирования,
  • оценка геномной выделенной ДНК,
  • анализ внеклеточной ДНК,
  • анализ олигонуклеотидов,
  • количественный и качественный анализ РНК, оценка RIN (индекса целостности РНК).

Вторая группа объединяет самостоятельные методы генетического анализа. Наиболее интересные из них:

  • генотипирование (STR фрагментов или SSR для растений, SNP, AFLP – метода, близкого к STR),
  • анализ продуктов после рестриктазного расщепления (RFLP),
  • валидация результатов геномного редактирования CRISPR/Cas9.

Предварительная оценка нуклеиновых кислотФрагментный анализ нуклеиновых кислот

Большая группа задач, для которых используются приборы Qsep – это анализ нуклеиновых кислот перед использованием других способов их исследования на концентрацию, фрагментированность, наличие примесей и ингибиторов ПЦР.

Решать эту задачу можно очень многими различными способами, все они указаны на слайде вместе с известными преимуществами и недостатками:

  • Гель-электрофорез: самый простой метод, который довольно специфичен, но дает очень приблизительно количественную оценку,
  • Спектрофотометрия: очень неточный и совершенно неспецифичный метод, потому что в спектре «засвечивается» достаточно большое количество всего того что пользователю не нужно. Преимущество метода заключается в том, что с помощью спектрофотометрии можно оценить наличие примесей в образце, которые не касаются нуклеиновой кислоты, то есть оценить чистоту пробы.
  • Флуориметрия, капиллярный электрофорез – это достаточно точные методы, чувствительность которых доходит до 0,01 нг/мкл по нижнему пределу оценки концентрации. Кроме того, они довольно специфичны, но с одной оговоркой: так как эти методы в основном работают по принципу интеркалирующих красителей, интеркалятор «цепляет» за собой определенные неспецифичные фрагменты и не дает точности в количественном определении.
  • ПЦР в реальном времени – а вот этот метод обеспечивает и точность, и специфичность, и позволяет оценить фрагментированность и наличие примесей.

Аппаратное обеспечение для предварительной оценки нуклеиновых кислотПредварительная оценка НК

Исследователи давно знают, что чаще всего для оценки нуклеиновых кислот применялись и применяются приборы Agilent: например, на слайде слева показан Bioanalyzer 2100, справа – улучшенные машины TapeStation, к которым все специалисты привыкли и считают их стандартом качества.

Но в актуальных условиях и с поставками техники Agilent есть определенные сложности, и дороговизна самих приборов и расходных материалов к ним приобретает особую значимость.

Поэтому уже много лет «Диаэм» предлагает своим клиентам альтернативу под названием Qsep. (Рис. 1)Стандарт кчества? Или мытак привыкли...?

Фрагментный анализатор Qsep – это прибор, который объединяет в себе гель-электрофорез, частично спектрофотометр (за исключением того, что чистоту исследуемого образца и наличие каких-то примесей он не покажет) и флуориметр. Если нет возможности или желания использовать в лаборатории несколько приборов, можно заменить их фрагментным анализатором Qsep. Большинство задач он решает. (Рис. 2)

Это продукция фирмы BiOptic, расположенной в Тайване; проблем с поставками у них нет, и они успешно поставляют в Россию приборы и расходные материалы.

Компания предлагает несколько семейств приборов, которые различаются по своим характеристикам.

Первая – Qsep1. Это три небольшие машины, между которыми есть небольшие отличия.

Например, Qsep1-Lite отличается от Qsep1 и Qsep1-Plus большей простотой программного обеспечения: у этого устройства нет возможности редактирования протоколов электрофореза. Самим производителем Qsep1-Lite позиционируется как «форезник» для учебных целей, то есть для того, чтобы пользователь взял картридж, «заточенный» под один метод, открыл в программном обеспечении предназначенный для него протокол, запустил его и получил результат. Отредактировать такой протокол под какие-то свои нужды в этом приборе нельзя.

У остальных приборов семейства эта возможность есть, они обладают полным функционалом. Qsep1 и Qsep1-Plus – это небольшие машины, максимальная загрузка для которых достигает 15 образцов за прогон.

Далее производительность растет.

В прибор Qsep100 можно поставить 96-луночный планшет и запустить электрофорез до 96 образцов в одном прогоне. Но это не значит, что туда нужно непременно ставить полную плашку. Прибор действует по принципу «один прогон – один образец», поэтому можно поставить хоть один, хоть 10, произвольное количество до 96, при этом перерасхода материалов для электрофореза (в частности, полимера, в котором происходит электрофорез) не будет.

И Qsep400 – прибор, в который можно загрузить планшет, но у него 4 капилляра, так что следует учесть ограничение: желательно ставить количество образцов, кратное четырем.

Характеристики устройств отображены на слайде: возможность проанализировать от 1 до 96 образцов, чувствительность определения – от 5 пг/мкл, продолжительность анализа – 2-7 минут на 1 образец, стоимость – от 1000000 рублей. С учетом того, что гель расходуется всегда только на целевой образец, и с учетом очень дешевых расходных материалов себестоимость анализа получается 0,5 доллара США за образец.

Расчеты показывают: если в качестве расходного материала брать упаковку из двух картриджей для самой рутинной работы, например самые простые картриджи S2, подходящие для очень большого количества применений (в том числе скрининга ПЦР и оценки библиотек), то 2 картриджа по 200 запусков вместе со всей химией к нему (маркерами и буферами) обойдутся пользователю в сумму порядка 10 тысяч рублей, то есть анализ одного образца будет иметь себестоимость 25 рублей – это очень неплохо.

Принцип действия капиллярного электрофореза в QsepКапиллярный электрофорез Qsep - принцип действия

В принципе действия капиллярного фореза нет ничего сложного: катодный конец, анодный, есть буфер, внутри картриджа находится полимер – скорее всего это обычный полиакриламидный гель, в котором уже имеется интеркалирующий краситель. При движении нуклеиновой кислоты от катода к аноду интеркалирующий краситель встраивается во фрагменты, в определенный момент проходит окно детекции, где его свечение детектируется. Все это происходит без денатурации.Как это работает?

Вот так выглядит картридж: отмечено место, где происходит детекция, внутри капилляр – игла, полимер поршнем проталкивается каждый раз при новом электрофорезе внутрь.

Первая стадия – проталкивание поршнем нового полимера внутрь капилляра: остатки старого фореза при этом уходят в промывочную емкость с водой.

Далее идет стадия забор образца путем электрокинетической инжекции.

Потом конец опускается в форезный буфер, подается напряжение, фрагменты начинают движение в геле и в определенный момент детектируется свечение. Результат детекции выводится в виде электрофореграммы, изображенной на слайде.

Различия в моделях QsepРазличия в моделях Qsep

В этих семействах приборов есть модели с небольшим количеством образцов, которые можно загрузить, и побольше – до 96.

Основные различия заключаются в количестве загружаемых образцов и типе адаптера, который могут использовать эти приборы.

Если брать модель Qsep1, которая была до недавнего времени практически единственной в своем роде, так как других не было – она могла использовать два вида адаптеров: на 4 образца (туда, где метки S1-S4, ставят 4 образца или 3 образца и леддер (ladder, маркер длины) – в лунку L/S4) если он необходим, а в остальные лунки ставятся маркеры, вода и буфер). Можно было также использовать адаптер, в который ставят до 8 образцов и вспомогательную химию.

В два описанных адаптера можно ставить неспецифичный пластик: с первым адаптером совместимы пробирки на 0.2 мл, пробирки на 0.1 и 0.2 мл; для второго – стрипы по 4 пробирки от производителя на 0.1 мл (С104252);

Более новая модель Qsep1-Plus может использовать оба этих адаптера, но для него также доступна возможность использования специального адаптера под специфический пластик, в который можно ставить до 15 образцов – пробирки С104254 в стрипах 0.1 мл, 1×16+3 для образцов до 10 мкл.

Кроме того, что у него специальный адаптер, у него есть еще и специальная центрифуга, в которой можно эти стрипы, подходящие к адаптеру, центрифугировать перед форезом.

Для Qsep1-Lite применяется упрощенное программное обеспечение, предлагающее только один протокол для каждого картриджа.

Различия моделей Qsep100 – есть две ходовые модификации, Qsep100 и Qsep100 Advance.

Эти биоанализаторы Qsep можно использовать для анализа не только ДНК, но и белков. Qsep100 работает на длине волны 525 нм, она детектирует белки со спецальным красителем Chromeo P-503, и для этого у приборов имеется специальный «белковый» картридж P1. Детекция флуоресценции у него проводится на длине волны 590 нм.

А модель Qsep100 Advance работает на длине волны 480 нм с белками, меченными красителями ALEXA488 или FITC. Детекция флуоресценции у этой модели – на длине волны 530 нм.

С картриджами серий S и N первая из моделей демонстрирует отличную чувствительность, Advance – хорошую.

Различные испытания показали, что этот вариант намного лучше для работы с белками: система Qsep100 Advance в основном подходит тем, кто работает с белками. Оба прибора могут работать и с нуклеиновыми кислотами, и с белками, но Advance лучше с белками при наличии, что они помечены указанными красителями. А Qsep100 больше пригоден для нуклеиновых кислот.

Расходные материалы для систем QsepКартриджи для систем Qsep

Так выглядят картриджи для систем Qsep: по 4 капилляра – для Qsep400, для остальных машин используются стандартные одноигольные картриджи.

В упаковке обычно поставляется 2 картриджа на 100-200 прогонов, форезный буфер, минеральное масло для предотвращения испарения образцов, маркеры, пластик – пробирки есть в комплекте.

Виды картриджей для QsepВиды картриджей

Картриджи для этих систем подразделяются на качественные и количественные, картриджи для нуклеиновых кислот и для белков.

«Качественные» картриджи имеют такое название только потому, что их основное направление – сам фрагментный анализ, а количественное определение уже вторично, хотя оно и есть – но не такое точное, как в «реалтайме».

В ассортименте есть следующие картриджи: стандартные S2 (номер в каталоге **C405101, C105201 (2 шт.), C105801 (8 шт.), разрешение 4-10 пар оснований), высокого разрешения S1 (номер в каталоге **C405102, C105202 (2 шт.), C105802 (8 шт.), 1-4 пары оснований), для быстрого скрининга F3 (Fast, номер в каталоге **C405103, C105203 (2 шт.), C105803 (8 шт.), с которыми форез идет всего 1-2 минуты (но с разрешением более 50 пар оснований). Также есть высокочувствительные картриджи N1 (номер в каталоге **C405105, C105105 (1 шт.), C105205 (2 шт.)) с количественным нижним порогом до 5 пг/мкл (почти у всех остальных картриджей этот порог 0.1 нг/мкл, исключения составляют картриджи для РНК), но нужно понимать, что при этом придется использовать другой маркер – не тот, который используется с остальными, а специальный маркер для количественного определения (разрешение более 10 пар оснований).

Есть картридж S3 (номер в каталоге **C405106, C105206 (2 шт.), C105806 (8 шт.)) для работы с геномной ДНК, который может работать с выделенными нуклеиновыми кислотами – до 50 килобаз (остальные – до 5 килобаз). И доступен высокочувствительный килобазный картридж N3 (номер в каталоге **C405153, C105153 (1 шт.), C105253 (2 шт.)), характеризуемый чувствительностью 20 пг/мкл. У обоих разрешение 10-50 пар оснований.

Кроме того, в наличии есть специальные наборы – так называемые количественные наборы S2 (номер в каталоге **C405101-Q, C105201-Q (2 шт.), стандартный, 4-10 пар оснований)) и S1 (номер в каталоге **C405102-Q, C105202-Q (2 шт.), высокого разрешения, 1-4 пары оснований), которые уже содержат в себе количественный маркер. Тем самым, используя этот набор, пользователь сможет более точно определять количественные характеристики исследуемых нуклеиновых кислот.

Есть картриджи для анализа РНК (R1 – номер в каталоге **C405110, C105110 (1 шт.), C105210 (2 шт.), C105810 (8 шт.), нижний порог обнаружения 5 рг/мкл, NR1 – номер в каталоге **C405111, C105111 (1 шт.), C105211 (2 шт.), нижний порог обнаружения 1 нг/мкл) и для белков (P2 – номер в каталоге **C405121, C105121 (1 шт.), C105221 (2 шт.)).

Картриджи в основном рассчитаны на 200 запусков (S1, S2 качественные и количественные, килобазный S3), исключения – «быстрый» картридж F3 на 300 запусков и группа картриджей на 100 запусков: N1, N3, R1, NR1 и P2.

Срок годности картриджей F3, N1, N3, R1, NR1, P2 составляет 4 месяца, картриджей S1, S2 (качественных и количественных) и S3 – 6 месяцев.

Все картриджи требуют объем пробы на 1 запуск менее 1 мкл.

Они используются с микропробирками 0.1 и 0.2 мкл, а качественные S1, S2, S3, F3, N3, R1 и NR1 – еще и с микровиалой C104250.

Основные ходовые картриджи – S1 высокого разрешения, S2, килобазные картриджи – это для работы с ДНК.

Рекомендуемое применение картриджейРекомендуемые применения картриджей

Если говорить о картриджах высокого разрешения, то сфера их применения такова:

  • Скрининг ПЦР, генотипирование (высокое разрешение заявлено у них до 1 нуклеотида, на практике не всегда получается в один нуклеотид, но в 2 точно получается);
  • Для валидации результатов геномного редактирования;
  • Для оценки NGS библиотек. Хотя здесь написано «NGS QC» (картридж S2), но исходя из практики: на S1 даже лучше получится, просто это выйдет чуть дороже, так как картридж S1 дороже, чем рутинный S2.

На килобазном картриже производится оценка геномной ДНК, оценка плазмид – опять же до 50 килобаз можно посмотреть.

В нижней части показаны более чувствительные картриджи: их применяют для анализа геномной ДНК, но это пригодится тем, кому нужно точнее оценить количественные характеристики.

Основное предназначение картриджа высокого разрешения N1 – это оценка образцов с низкой концентрацией и образцов внеклеточной ДНК

Картриджи для работы с РНК – их также два, один стандартный для большинства применений анализа РНК, а картридж высокой чувствительности пригодится при низкой концентрации образцов.

О «белковом» картридже понятно, для чего он применим – для исследования белков с чувствительностью 0.5 нг/мкл (по БСА).

Результаты, получаемые на Qsep

Вашему вниманию представлены примеры оценки геномной ДНК на килобазном картридже S3. Можно видеть, что получилось: ДНК хорошего качества, пригодная для дальнейшей работы, виден пик примерно на 7500 и шмер (размытая полоска ДНК, идущая от старта до финиша, фон, на котором бывает трудно увидеть целевые пики), который показывает, в каких пределах находится выделенная ДНК.

По таблице прибор покажет все фрагменты: диапазоны длин, которые он посчитал, их примерные концентрации, можно задать интервал длин, в котором он будет вести подсчет.Анализ результатов электрофореза - геномная ДНК

Другой пример: по оценке такой же ДНК, но видно, что образец очень сильно фрагментирован, в связи с чем никакой «красоты» не получилось:Анализ результатов электрофореза - геномная ДНК-2

Один из примеров анализа библиотек NGS: так оценивали библиотеку перед секвенированием на секвенаторе ThermoFS Ion GeneStudio S5 System, используя картридж S1. Задан интервал в 20 пар нуклеотидов: таблица показывает примерную концентрацию в каждом диапазоне. Видно, что максимум приходится на 290 нуклеотидов с концентрацией 0.34 нг/мкл. (Рис. 3)

Пример анализа целостности РНК: можно увидеть, что в данном случае взята РНК достаточно высокого качества с индексом целостности (у Qsep он называется не RIN, как у Agilent, а RQN, и здесь он близок к 10 (9.83) – принцип расчета тот же, по соотношению пиков 18S и 28S рибосомальной РНК. В данном образце он практически равен 10, это очень хорошее качество. (Рис. 4)

На следующем изображении этот индекс пониже – около 7, и по идее это нужно рассматривать как признак РНК низкого качества. Но недавно, показывая эти результаты в Томске, автор вебинара выяснил, что в принципе специалисты, которые занимаются там исследованием РНК, готовы работать и при наличии РНК с таким индексом – для них это нормально, это дело опыта.Анализ целостности РНК-2

Еще одно из применений – генотипирование. Для примера представлен один из образцов – генотипирование растений по SSR локусам. Это результат, предоставленный из института исследования кормов в Лобне, куда «Диаэм» летом 2022 г. поставила прибор, который успешно начали использовать для решения задач по генотипированию, которые раньше решали путем электрофореза и гель-документирования. Здесь можно видеть аллель длиной 152 нуклеотида, остальные пики отображают праймеры – вывод: это гомозигота.Генотипирование (SSR)

Еще одно из применений Qsep – электрофорез белков. На представленном приборе это получается лучше, чем обычный форез в полиакриламидных гелях: во-первых, здесь происходят и анализ, и детекция внутри картриджа, во-вторых – происходит автоматическая обработка результата, а результат виден на экране – результаты обработки свечения флуоресценции. Здесь более высокое разрешение, как заявляет производитель, чем это будет при форезе в обычной форезной камере.

Четкая программная обработка анализа результатов делает свое дело. (Рис. 5)

Есть другие примеры электрофореграмм, сделанных на Qsep для определения молекулярных масс различных белков. (Рис. 6)

Комплектация приборов Qsep

В комплект поставки прибора входит сам основной агрегат, а также необходимое дополнительное оборудование к нему: воздушная помпа, которая качает воздух через картридж и толкает полимер, стартовый набор стандартных картриджей S1 и S2 – высокого разрешения и рутинный – со всей необходимой химией: буфером, маслом, маркерами – размерными и леддером (ladder).

В комплекте поставки Qsep1 идут адаптеры: у остальных моделей (Qsep100, Qsep400) автосэмплер внутри. Адаптеров у Qsep1 два, у Qsep1-Plus – три.

Можно приобрести полезную опцию – продувочную станцию: случается, что концики при длительном хранении картриджей засыхают, в таком случае их можно продуть и промыть – бывает, что такая процедура помогает.Комплектация приборов

Преимущества приборов Qsep по сравнению с аналогами других производителей

Если сравнить Qsep с другими машинами, которые использовались ранее или в настоящее время, следует отметить такие моменты.Сравнение с основными аналогами

(В качестве аналогов для сравнения с Qsep100 от BiOptic взяты QIAxcel Advanced от QIAgen и TapeStation System 4200 от Agilent).

Все эти приборы могут работать с количеством образцов до 96. Но, например, у QIAxcel есть неприятный момент: у него 12-игольный картридж, соответственно при постановке меньшего количества образцов пойдет перерасход геля, а значит, нужно брать количество образцов, кратное 12.

Разрешение у Qcep на картриджах S1 явно выше, чем у других моделей. Тем, кому нужно высокое разрешение – например, в том же генотипировании – эти машины больше подходят.

Нижний порог определяемых концентраций при использовании количественного маркера и предназначенных для этого картриджей тоже выше – до 5 пг/мкл.

Qsep действительно не такие скоростные: это связано с тем, что они, кроме последней модели Qsep400, обрабатывают по 1 образцу за форез, но зато они при этом дешевле в сравнении с остальными машинами при всех более или менее сходных с другими параметрах.

Цены на слайде приведены примерные, но разница видна: Qsep почти вдвое дешевле аналога от QIAgen и в 3,33 раза дешевле оборудования от Agilent.

И самое главное – стоимость расходных материалов: как уже упоминалось в начале доклада, при различных рутинных исследованиях порог себестоимости анализа одного образца составляет до 25 рублей.

Если сравнить с аналогичным параметром у Agilent, например, на старом Bioanalyzer, при полной загрузке чипа у него получается стоимость одного образца примерно в десять раз больше.

Дополнительные вопросы по оборудованию и расходным материалам можно задать по телефону +7-927-880-36-76 или электронной почте nba@dia-m.ru.

Новость о вебинаре «Генетический анализ: доступные инструменты для молекулярной генетики»

Другие части вебинара:

Ссылка на вебинар «Секвенирование нуклеиновых кислот: с чем работать генетику в новых условиях»


Возврат к списку

Ваш заказ будет обработан
в ближайшее время.
Мы пришлем уведомление, как только все будет готово. Спасибо!