История
История
Биология в формате SingleCell-RNA-Seq: от общности к частности. Применение технологии Single nucleus RNA-Seq для анализа транскриптома клеток (транскрибация видеозаписи вебинара лектория Диаэм сезона 2022)
Содержание статьи:
Эта публикация отражает содержание вебинара «Биология в формате SingleCell-RNA-Seq: от общности к частности!», состоявшегося 25 октября 2022 г. в рамках проекта «Онлайн-лекторий Диаэм».
Специалист «Диаэм» Сергей Ирхин рассказал о методиках и аппаратном обеспечении изучения транскриптома, значении таких исследований и роли микрофлюидики в развитии этого направления молекулярной генетики.
Если говорить о биологии в формате единичных клеток, невозможно обойти стороной тему транскриптома, изучение которого приобретает сегодня особую актуальность.
Классическая догма биологии утверждает, что в клетке есть ДНК, с которой происходит переписывание (транскрипция) информации в виде мРНК, а на основании этой переписанной информации осуществляется синтез белка.
Это, казалось бы, понятно, но несмотря на единообразие генома всех клеток отдельно взятого человека (или иного организма) эти клетки проявляют довольно-таки разные фенотипы. У нас есть дифференцированные клетки, например, эпителия, миоциты, нервной ткани. Геном у всех них одинаковый, но выглядят они по-разному, и возникает вопрос: почему?
Ответ кроется в различной интенсивности синтеза транскриптома и соответственно различной экспрессии тех или иных генов в определенных клетках. И хотя гены во многих клетках одного организма одинаковые, разные клетки ведут себя по-разному.
И в связи с этим интересно изучить влияние внешних факторов, факторов окружения на синтез тех или иных белков клетки – не только тех, которые выделяются во внешнюю среду, но также сигнальных белков, каких-то соединений, которые запускают те или иные процессы внутри организма, изменяют фенотип клетки, ее поведение и дальнейшую судьбу.
Представляет интерес изучение транскриптома для разработки и тестирования эффективности фармацевтических препаратов, разработки препаратов с селективным действием на клетки. Зная, что и как возможно в клетке блокировать, можно заблокировать какой-то фактор (белок), ингибировать его, отключить и тем самым изменить течение некого патологического процесса. Можно и добиться улучшения какого-то процесса за счет усиления выделения соответствующего ему белка: даже если клетки его вообще не производят, можно попытаться этот синтез запустить при условии, что не нарушен процесс транскрипции с ДНК на мРНК.
Интересно также изучение роли внешних факторов – например, радиации, в том числе космической радиации, перегрузок и т.д., – влияющих на запуск тех или иных механизмов клетки. Все внешние воздействия тем или иным образом влияют на клетку и в ней как ответная реакция запускается считывание тех или иных генов, что проявляется в виде белка.
Не меньший интерес представляет изучение влияния опухолевых клеток на соседние здоровые клетки (влияние опухолевого микроокружения на здоровые ткани) и влияние опухолевых клеток друг на друга. Известно, что опухоли в большинстве случаев гетерогенны по составу, и зачастую некоторые клетки начинают отмирать, а другие при этом начинают развиваться интенсивнее, в итоге у пациента развиваются рецидивы – уже поэтому не менее интересно изучить влияние опухолевых клеток друг на друга.
Но классический анализ транскриптома биоматериала по совокупным мРНК дает информацию, которую можно охарактеризовать как «средняя температура по больнице»: исследователь видит общую картину, но не понимает, что именно и где происходит.
У него есть общая информация о том, что присутствуют те или иные мРНК, но при этом невозможно соотнести такой факт с данными поклеточно. Нельзя сказать, что определенный процент клеток экспрессируют такой-то белок, а другая их часть – другой белок. Анализ мРНК с применением классических подходов дает лишь понимание, что в образце присутствует и то, и другое.
Дело в том, что ткани неоднородны по составу и могут включать не только целевые клетки, но и другие: сосудистые, железистые, соединительной ткани. Это, в частности, обусловливает проблемы в изучении таких неоднородных опухолевых популяций.
Это следует учитывать и при анализе лейкоцитарной фракции крови, потому что помимо клеток, ответственных за выработку антител (если нужно определить репертуар иммунокомпетентных клеток на уровне мРНК) в пробе будет попадаться и много других клеток, которые экспрессируют какие-то другие антитела.
Кроме того, чаще всего биоматериала может быть просто очень мало: хирурги-онкологи берут биоптат из опухоли, стараясь не особо ее тревожить, чтобы избежать распространения ее клеток, распространения метастаз, усиления роста. Такой материал обычно забирают откуда-нибудь с периферии опухоли, и такие препараты обычно содержат мало репрезентативных клеток, которые собственно и интересны для исследователя, зато в них очень много клеток соединительной ткани, клеток окружения (если опухоль доброкачественная). Еще больше будет разнообразие клеток в злокачественной, но целевых клеток в любом случае будет очень мало.
Все вышесказанное подводит к необходимости проведения исследований на уровне единичных клеток. Но как отделить зерна от плевел?
Ученым пришла на помощь микрофлюидная технология, позволившая изолировать клетки в отдельные капельки и затем проанализировать их транскриптом, с помощью биоинформатических методов сопоставив, какой фрагмент к какой капельке относится. Эта технология решает проблему идентификации, позволяет определить, какой клетке соответствует какой качественный фрагмент.
Капли образуются во фторуглеродном масле, которое содержит ПАВы, и скорости потока подобраны таким образом, чтобы в одну капельку попала одна частица, которая сорбирует на себе всю совокупность мРНК, и одна клетка. Вероятность дуплетов – попадания двух клеток или двух частиц в одну капельку – очень мала. Это позволяет создавать тысячи изолированных систем реакции, и в каждой капельке реакция будет идти изолированно от соседних.
В микрофлюидной технологии используют две концепции
Первая – Drop-seq – это сорбция мРНК на поверхности частиц-носителей («бидсов»). В этом случае процесс лизиса идет в капле, и все мРНК, которые содержались в одной клетке, попадают в эту каплю и сорбируются на поверхности носителя. Этап обратной транскрипции отделен от процесса лизиса клеток, чтобы повысить эффективность лизиса. Скорость захвата клеток зависит от типа используемого шарика. При этом количество обнаруженных генов на одну клетку находится на высоком уровне.
Вторая – inDrop – тоже с шариком гидрогеля, изначально имеющим фотоотщепляемый олигонуклеотидный штрих-код. Здесь уже и реакция обратной транскрипции, и лизис идут в одной капле. При этом обеспечена высокая скорость захвата клеток, но количество обнаруженных генов на одну клетку может быть и средним, и высоким.
У такой методики есть плюсы и минусы у него, и сейчас речь пойдет о первой методике, разработанной Алланом Кляйном и Эваном Макоско и реализованной в 2015 г.
Если говорить об области применения таких технологий на основе микрофлюидики, то их много.
Первая и наиболее востребованная в контексте последних пандемий – это профилирование рецепторов В- и Т- клеток, изучение иммунной реакции организма на уровне мРНК отдельной клетки. Зная последовательность, кодирующую вариабельный фрагмент антител, можно использовать методы генной инженерии и создать штаммы e. coli или дрожжей для продукции иммуноглобулинов, которые далее могут использоваться, например, для диагностических целей, для создания высокоспецифичных диагностических наборов и т.д. И это все происходит очень быстро: от выявления последовательности до реализации в промышленных масштабах проходит не так много времени, что важно в условиях быстро распространяющихся пандемий.
Интересно применение этой технологии в изучении неоднородности гетерогенных опухолей и изучения влияния такого клеточного окружения на здоровые ткани.
Востребован такой подход для изучения мРНК нейрональных тканей из замороженных, архивных образцов.
Кроме того, технология открывает возможности по части количественной оценки экспрессии генов на клеточном уровне при болезни и в нормальном здоровом состоянии.
Кроме того, рассматриваемый подход делает более эффективным скрининг эффективности новых лекарственных препаратов для оптимизации терапии: теперь можно посмотреть, как влияет препарат на все типы клеток, из которых состоит какая-то опухоль, оценить, что нуждается в оптимизации. Это важно, потому что в онкологии зачастую наблюдается такая картина: онколог назначает некий препарат, который эффективен в отношении наибольшей популяции клеток новообразования, после подавления которой опухоль сначала уменьшается. Но в силу гетерогенности опухоли на первый план может выйти некая минорная популяция, которую изначально пропустили и потому лекарство не было активно в ее отношении. После подавления основной популяции эти клетки получают пространство для роста и опухоль вновь начинает прогрессировать, причем, раз освободилось место – рост происходит стремительно, наступает рецидив. При этом врачи пытаются применить против вновь растущей опухоли те же препараты, что и прежде, но поскольку в ней уже несколько иные клетки, препарат может быть неактивным в отношении такой рецидивирующей опухоли. И это надо тоже учитывать.
Протокол, используемый в технологии Single Cell RNA-Seq, занимает суммарно два дня от получения образца до создания библиотеки.
Нужно выделить ядра из тканей, для чего понадобится либо диссоциировать ткань до состояния единичных клеток, либо использовать готовую эмульсию (суспензию) клеток. Далее нужно сгенерировать эмульсию капель, в которых содержатся клетки и частицы («бидсы»). Лизис будет происходить прямо в этих каплях: после разрушения капли происходит синтез кДНК и амплификация, затем очистка продуктов ПЦР, контроль качества последующего сиквенса. На выходе после этой процедуры генерации капель мы получаем библиотеку кДНК
Первый этап самый непродолжительный, занимает 15-30 минут в зависимости от количества образцов. Это собственно получение суспензии клеток: нужно диссоциировать ткани, если необходимо секвенировать ядра – нужно их выделить, если предстоит работать с протопластами – нужно их тоже выделить для дальнейшей инкапсуляции в капельки.
Исследуемый материал может быть самый разнообразный: клетки лейкоцитарной фракции крови, биоптат, клетки какой-то суспензии, протопласты растений, дрожжи и т. д. – все ограничивается лишь воображением исследователей.
Далее происходит генерация эмульсии с помощью биоинертного масла от Bio-Rad QX200.
К микрочипу подается масло, которое отсекает жидкость, и за счет Y-образного соединительного канала в капельку попадают одна частица и одна клетка – такая точность обеспечивается за счет правильно подобранных скоростей подачи потоков клеток и частиц. Уникальность технологии состоит в том, что система очень чувствительна и позволяет очень точно регулировать скорости этих потоков и получать оптимальное соотношение клеток и частиц.
После генерации эмульсии начинается лизис клетки: буфер, в котором подаются частицы, содержит лизирующий агент для клетки. На частицу он не действует, на клетку начинает воздействовать в момент попадания клетки в каплю. При этом происходит разрушение клетки и освобождение всей мРНК, которая в клетке содержится. И, поскольку мРНК имеет поли-А-хвостик, за него всю эту мРНК можно «поймать» на поверхности частицы, на которой для этого есть олигонуклеотиды с поли-Т-хвостом: их много, порядка несколько тысяч, и они позволяют выхватить всю совокупность мРНК, что и требуется на данном этапе: неважно, что эти мРНК кодируют, важно их деликатно «поймать».
Упомянутые олигонуклеотиды содержат праймер для синтеза кДНК, клеточный баркод, по которому с помощью ПО можно будет определить порядковый (регистрационный) номер клетки, которая была разрушена в капле, и UMI – так называемый уникальный молекулярный идентификатор, который кодирует собственно «пойманную» мРНК. Получается, что у олигонуклеотидов в одной капле баркод будет одинаковым, но UMI – разным у всех. По cell-баркоду можно соотнести, какая это была клетка, а по UMI – идентифицировать конкретную мРНК.
На четвертом этапе происходит синтез кДНК. Это довольно длительный и не самый приятный процесс, потому что с образцом требуется произвести очень много манипуляций: отмывку эмульсии, разрушение ее перфтороктанолом или через специальный фильтрующий модуль, который поставляется в составе набора, после отмывки – ферментативное удаление частиц праймеров без мРНК, то есть разрушение всех олигонуклеотидов, которые не связали ничего, и наконец синтез кДНК с последующей амплификацией и получением фрагментов.
Что касается разрушения эмульсии: для этого используются химические агенты, разрушающие слой ПВА – стабилизаторов эмульсии, в результате чего происходит расслоение масла и воды. Перфтороктанол – один из вариантов.
Второй вариант – прогонка эмульсии через фильтр 100 или 70 мкм: при продавливании эмульсии через фильтр на выходе получается расслоенная жидкость. На дне оседает гидрофильная фаза, сверху – гидрофобная масляная фаза. Аккуратной декантацией можно слить масляный слой, а частицы с «пойманными» РНК остаются на дне и могут быть проанализированы далее. Либо при работе с клетками для создания штамма эффективных продуцентов, о чем речь пойдет далее, e. coli или другая целевая клетка тоже остаются в водной фазе – их можно переместить в питательную среду и растить дальше. В любом случае разрушать эмульсию и высвобождать содержимое капелек необходимо для дальнейшей работы: от клетки или «набора» РНК в капле толку мало.
Если же говорить об инкапсуляции в агарозную частицу, с такой эмульсией работать проще: во-первых, агарозные шарики можно сортировать на сортере, не боясь забить его или запачкать, кроме того – агароза через какое-то время деградирует сама.
На этом этапе после разрушения эмульсии на выходе получается совокупность баркодированных кДНК. Перед тем, как «загонять» эту смесь в NGS секвенатор, ее нужно очистить – это происходит на магнитном штативе с помощью частиц AMPure XP (производитель – компания Beckman).
С учетом текущей ситуации и ограничения доступа российских пользователей к этим наборам можно предложить отличные китайские наборы Vazyme, которые являются стопроцентным аналогом AMPure XP (заинтересованные в этой продукции могут задать вопросы по ней в индивидуальном порядке).
То же касается и приборов Qubit и наборов Qubit: определение концентрации кДНК производится с использованием прибора Qubit 4 и набора dsDNA HS assay. Понятно, что приборы эти есть не у всех, но в «Диаэм» нашли хорошие аналоги и приборам, и наборам.
Итак, на данном этапе из смеси убирают «мусор», определяют концентрацию кДНК и производят качественный анализ библиотеки с помощью Qsep100 от BiOptic или Bioanalyzer от Agilent.
В принципе очищенная библиотека кДНК может храниться при -20ºС несколько недель, так что «можно выдохнуть и заняться чем-то другим», в частности подкопить количество образцов, съездить в отпуск и т.д. От первого до пятого шага проходит 2-2.5 дня.
Нужно отдать должное производителю наборов для приготовления библиотек кДНК: в поддержке предоставлена действительно пошаговая инструкция, в которой для каждого этапа описано, что делать в первый день, где можно остановиться и отложить работу. То, что все операции в инструкции прописаны детально и с комментариями (рекомендациями), очень облегчает работу пользователю.
Мечение амплифицированной кДНК с помощью набора Nextera XT Kit позволяет адаптировать кДНК к секвенированию с помощью платформы NextSeq 500. Пользователю стоит обратить внимание: набор Nextera Kit не входит в комплект поставки и заказывается отдельно.
В случае необходимости мультиплексирования (если пользователь анализирует за один прогон несколько образцов) следует применять Nextera XT Index Kit (Illumina #FC-131-1002). Этот набор позволяет произвести мультиплексирование и повысить производительность системы.
На выходе после секвенирования пользователь получает некий биоинформатический массив, который необходимо проанализировать.
Для этого рекомендуется использовать ПО от компании Partek (протокол Flow). Эта система адаптирована для анализа данных, полученных на платформе Illumina.
Как пример: произведено секвенирование популяции клеток мыши и человека, причем на выходе было произведено четкое разграничение по популяциям: упомянутые популяции клеток были четко идентифицированы и разграничены.
Все, о чем мы говорили, можно делать с помощью двух приборов – Nadia Instrument и Nadia Innovate.
Разница между ними в том, что Nadia Instrument – это прибор для рутинного процесса: «поставили, капнули, прибор подсветил, куда что капать, нажали кнопки для запуска процесса, ушли пить чай, через 20 минут пришли, забрали готовую эмульсию и начали с ней работать».
С Nadia Innovate происходит немного по-другому: в этом приборе есть микроскоп, позволяющий наблюдать за процессом, разрабатывать собственные протоколы инкапсуляции ядер и клеток с возможностью редактирования протоколов по усмотрению пользователя. Такие протоколы впоследствии можно экспортировать с системы и использовать в Nadia Instrument.
Но система рассчитана на один образец, в то время как Nadia Instrument может работать с 1, 2, 4 или 8 образцами параллельно, и это существенно увеличивает производительность системы.
При этом в Nadia Instrument используются одноразовые чипы с RFID метками, что с одной стороны накладно, но с другой стороны, если учесть стоимость наборов для секвенирования, предохраняет от неприятного явления – получения контаминированных образцов, поэтому очень важно при выполнении таких задач соблюсти максимальные стерильность и чистоту.
А с Nadia Innovate проще: чипы можно использовать сколь угодно раз – на свой страх и риск, но здесь все многоразовое, нет никаких датчиков.
Сенсорный экран подразумевает простой интерфейс и встроенную систему подсказок.
Встроенные магнитные приводы для мешалок: чипы для Nadia и Nadia Innovate имеют встроенные мешальники для ресуспендирования клеток и шариков в картридже бережным перемешиванием.
Безымпульсные пневмонасосы подают давление в каналы, за счет чего все жидкости – суспензии с частицами («бидсами»), клетками и так далее – проталкиваются в микроканалы и происходит «чудо» генерации капель.
Встроенная система подсветки подсказывает пользователю, куда что капать и помещать, в какую лунку – эти лунки подсвечиваются, и такая функция прибора минимизирует риск ошибки пользователя.
У прибора есть встроенный температурный контроль для термостатирования образцов в диапазоне 4-40ºС: после того как система сгенерирует эмульсию на основе образца, она будет термостатировать ее при +4ºС для максимальной сохранности полученной эмульсии.
Система дает высокое качество результатов; здесь есть возможность автоматического охлаждения образцов для наивысшей сохранности транскриптома.
Никакой кросс-контаминации: поскольку все картриджи одноразовые, исключен риск контакта образцов между собой и между образцом и прибором.
Простота в работе обеспечивается за счет автоматической идентификации картриджей и сенсорного экрана: прибор понимает, какой картридж от какого набора в него вставили и что будет делать пользователь – и соответственно подбирает протокол из записанных в его память.
Встроенная система подсказок в зависимости от протокола подсвечивает те или иные лунки.
К преимуществам Nadia Instrument можно отнести широкий диапазон применения: у прибора есть несколько отработанных протоколов под разные типы образцов.
Сейчас это пять протоколов: инкапсуляция в агарозу, в альгинат, инкапсуляция протопластов, Single Cell RNA-seq и Single Nucleus RNA-seq. По мере поступления обновлений доступных протоколов их можно загрузить в прибор с помощью флеш-носителя.
Благодаря высокой точности контроля в данном приборе пользователь получает настоящий Single Cell с минимальным уровнем дуплетов: явление, когда в одну капельку попадает несколько клеток – редкость в данном случае, и это дает преимущество по точности анализа.
Так выглядят картриджи: это одноразовые пластиковые конструкции со встроенными чипами и мешальниками, они могут быть рассчитаны на 1, 2, 4 или 8 образцов, что позволяет увеличить производительность и дает гибкость в использовании. Если у пользователя мало образцов, он может заказать одноканальные картриджи и работать в формате единичного образца. Если же потоки увеличиваются, например, получен грант на какое-то скрининговое исследование, то придут на помощь 8-канальные чипы – можно за те же 15 минут получить эмульсию из 8 образцов. При этом качество таких эмульсий будет одинаковым, потому что используются максимально одинаковые протоколы для всех образцов.
Встроенная NFC метка на картридже позволяет подобрать автоматически параметры инкапсуляции и предотвращает повторное использование образца и картриджа.
В каждом чипе для каждого образца есть два встроенных мешальника с магнитным приводом, которые деликатно перемешивают суспензии клеток или частиц, чтобы предотвратить агрегацию.
Так выглядит микрофлюидный картридж: показаны магнитные приводы на мешальниках, канал Bead Input Chamber, куда заливаются частицы («бидсы»), два больших резервуара: туда заливают по 2,5 мл образца, а в Oil Input Reservoir заливается масло от Bio-Rad. В Cell input chamber заливают суспензию, которую потом нужно будет разрушить, синтезировать кДНК, амплифицировать, очищать и анализировать данные.
Что касается точности метода дозирования: интенсивное перемешивание позволяет снизить количество дуплетов, и приведенный на слайде график отображает результаты того же эксперимент по инкапсуляции суспензии мышиных и человеческих клеток (по 3000 каждых). Если оценить количество сиреневых точек (дуплеты) на графике, оно относительно невелико: количество дуплетов не превысило 7% в эксперименте.
Несмотря на то, что в этом приборе используются принципиально очень похожие картриджи, выглядит он немного по-другому. Здесь есть микроскоп, с помощью которого пользователь сможет увидеть, как ведется инкапсуляция, и редактировать протокол непосредственно во время процесса.
Как и у Nadia Instrument, есть встроенный модуль для перемешивания; камера рассчитана всего на один чип. Есть термоконтроллер, предметный столик для лучшей обсервации процесса: пользователь сможет наблюдать, как производится инкапсуляция каких-то нестандартных клеток, проверить, нет ли забивания каналов из-за того, что клетки нестандартные, визуализировать, наглядно посмотреть процесс, изменить положение чипа под микроскопом.
Преимущества системы в том, что она довольно открытая.
Если у Nadia Instrument нет возможности редактировать протоколы, но в Nadia Innovate можно менять все параметры: скорость, температуру, время, скорости потоков одного и второго растворов, размешивающей фазы. Это определяет гибкость применения. При этом можно использовать реагенты любых производителей и получать некий результат, если это интересно пользователю.
В этом приборе нет возможности использования многоканальных чипов, но зато предусмотрена возможность масштабируемости: можно переписать отработанный протокол на флеш-носитель и перенести его на основной прибор Nadia Instrument, тем самым перейдя к более процессивной системе и обеспечивая большую производительность.
Программное довольно простое: создание нового эксперимента занимает всего несколько минут, потом нужно нажать кнопку «старт» и запустить процесс.
Основным преимуществом можно считать визуализацию процесса за счет встроенного в систему микроскопа с цифровой камерой. С его помощью можно записать процесс, отсмотреть какую-то часть чипа, оценить ход инкапсуляции: это и наглядно, и очень увлекательно и интересно.
Чип для Nadia Innovate похож на аналогичное устройство для Nadia Instrument за некоторыми исключениями. Например, в кружочке, в котором у чипа Nadia Instrument есть RFID метка, регистрируемая системой, у Nadia Innovate ее нет. Есть только сам картридж, в который мы заливаем реагенты и ставим в прибор – он совместим только с Nadia Innovate. По конструкции он не отличается от одноразовых картриджей, а кроме отсутствия RFID метки отличие состоит только в невозможности использования картриджа для более чем одного образца одновременно.
Возвращаясь к сравнению приборов, отметим, что Nadia Instrument – это автономный прибор без визуализации и с возможностью использовать только готовые протоколы, в то время как Nadia Innovate и вышедший сейчас его обновленный аналог под названием Nadia Go (в отличие от предшественника, тоже автономный прибор с многоразовым чипом только на один образец) – это платформа, открытая для любых инноваций, реагентов, пользовательского редактирования протоколов, а также визуализации с созданием видеозаписи и фотографий процессов, что может быть важно для публикаций в научных изданиях.
Примерная стоимость картриджей и наборов для приборов Nadia на момент проведения вебинара приведена на слайде (актуальные цены нужно смотреть на сайте «Диаэм»).
Например, 8 картриджей Nadia для scRNA-Seq (DolomiteMicrofluidics) на 1 образец стоят 115141 руб., что дает сумму 14392.62 руб. на 1 образец.
А 1 картридж Nadia для scRNA-Seq (DolomiteMicrofluidics) на 8 образцов стоит 71990 руб., что дает сумму 8003.00 руб. на 1 образец.
Пять таких же картриджей Nadia для scRNA-Seq (Dolomite Microfluidics) на 8 образцов в одной упаковке стоят 320151 руб., что дает сумму 14392.62 руб. на 1 образец.
Наборы дороже: набор реактивов на 8 образцов стоит в районе миллиона, 939574 руб., то есть 117446.75 тыс. руб. за образец. Можно сказать, что это недорого, точнее – дорого, но включает все необходимое с учетом поставленной задачи, а потому цена оправдана. В состав набора входят буферы для клеток и частиц («бидсов»), сами баркодированные частицы ChemGenes Barcoded beads, масло, раствор для разрушения эмульсии, буферы для отмывки частиц, реакционная смесь для обратной транскрипции, реакционные смеси с экзонуклеазой и для ПЦР.
Итак, когда есть такой набор и отдельно к нему приобретен картридж (чип), пользователю ничего больше не нужно: можно спокойно работать: под рукой все необходимые буферы – фосфатный, БСА для отмывки, для промывки частиц, олигонуклеотиды, ингибиторы РНК… – то есть все есть в одной коробочке, и имея ее можно начинать работу, не опасаясь, что какой-то реактив забыт.
Дополнительно потребуется еще культуральная среда, различные ферменты для диссоциации клеток, наборы для очистки, для анализа концентрации выделенной кДНК, оценки ее качества и соответственно набор Nextera.
Итак, к преимуществам этой системы можно отнести:
- Гибкость – можно процессировать под протокол от одного до 8 образцов параллельно;
- Контроль температуры для большей сохранности транскриптома;
- Встроенная система перемешивания частиц, что на выходе дает уменьшение количества дуплетных капель;
- Возможность редактирования скорости потока или редактирование протокола в целом удобно при работе с клетками большего размера, например, с нейрональными клетками, а также при использовании каких-то буферов, отличающихся по вязкости от фосфатного – например, если пользователь работает с протопластами или с какими-то агарозными растворами.
Список публикаций с применением описанной системы растет: на слайде приведена одна, в действительности их количество, конечно, существенно больше.
Помимо секвенирования, описанные системы могут быть интересны в решении других задач.
В исследовательской иммунологии методы секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) применяют для лучшего понимания развития болезни и иммунных реакций организма на какого-то возбудителя.
Те, кто работает с растениями, могут задействовать этот метод для анализа протопластов растений как части исследования транскриптома растения. Существует готовый протокол, адаптированный для работы с протопластами растений в вязком буфере. Можно проанализировать до 250 метагеномных профилей на клетку (или до 6000 на образец).
Пример – одна из публикаций, в которой использовался прибор Nadia для инкапсуляции протопластов растений и последующего приготовления библиотек кДНК для секвенирования методом NGS на приборе NextSeq.
Интересно применение описанной технологии для создания рекомбинантных штаммов-продуцентов.
Этот интересный набор не относится к генетике, но позволяет решать важную задачу – инкапсуляцию клеток в агарозу или альгинаты для наработки 3D-сфероидов или изоляции штаммов репродуцента.
У такого применения есть несколько направлений.
Например, инкапсуляция двух типов клеток в капсулу агарозы позволяет изучить межклеточное взаимодействие, межклеточную сигнализацию в динамике, макрофагальную и цитотоксическую активность клеток в отношении раковой клетки или возбудителя (например, простейших), изучить клеточные методы онкотерапии (CAR-T) и не только.
Можно какое-то время совместно инкубировать в одной капле два типа клеток, затем разрушить эту капсулу и изолировать клетки методом ssRNA-seq и посмотреть, как это соседство повлияло на уровень транскриптома в каждой клетке, сопоставить с нативным образцом и сделать выводы о том, что данное соседство влияет или не влияет на какие-то характеристики.
Если же говорить о работе с клетками-продуцентами, прежде всего стоит упомянуть инкапсуляцию бактерий e. coli: данная технология позволяет изолировать единичные клетки e. coli для оценки перспективности использования конкретной клетки для неких биотехнологических целей.
Проблема с e. coli в том, что их можно трансфицировать – «загнать» туда какую-нибудь плазмиду, которая отвечает за выработку определенного белка, но после этого невозможно отсортировать клетки степени их эффективности в отношении экспрессии целевого белка: они этот белок не накапливают, а выбрасывают наружу.
Невольно напрашивается аналогия: на вид все клетки одинаковые, а работают по-разному, как в человеческом сообществе есть лентяи и есть работяги.
Технология на основе микрофлюидики позволяет изолировать каждую клетку, и в итоге каждый экземпляр e. coli будет вырабатывать белок, выбрасывая его не в пространство пробирки, а внутрь капельки, в которой находится единственная клетка. Если в капле находится определенный индикатор, по мере накопления целевого продукта он изменит цвет, начнет светиться или по-иному изменит оптические свойства, что позволит с помощью сортера отсортировать «работяг» от «лентяев» и использовать работяг для получения некого биотехнологического штамма – например предназначенного для синтеза гормона, антител. Технологии из разряда Single Cell позволяют отобрать лучших продуцентов, которые дают большие объемы «хорошего» (целевого) белка.
Основные преимущества систем Nadia в сравнении с конкурентами – это:
- контроль температуры;
- возможность варьировать количество образцов;
- встроенная система перемешивания для предотвращения образования дуплетов.
Такие ключевые технологические особенности позволяют выделить системы Nadia в ряду подобных приборов разных производителей.
В настоящее время системы есть в наличии на складе «Диаэм».
Дополнительные вопросы по этой продукции можно задать по телефону +7(985) 929-67-28 или электронной почте sir@dia-m.ru.
Новость о вебинаре «Биология в формате SingleCell-RNA-Seq: от общности к частности!»
С помощью личного кабинета Вы сможете:
Сравнение
