Визуализация стала еще доступнее! Красители с короткими сроками поставки (Lumiprobe, Россия)

16.09.2022

Диаэм совместно с компанией Lumiprobe расширяет линейку флуоресцентных красителей для ваших исследований. Доставка данных красителей осуществляется в течение 30 дней!

Реагент H2DCFDA (2′,7′-Дихлородигидрофлуоресцеин диацетат), Набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

Флуоресцентные красители (также известные как флуорофоры/реактивные красители) молекулы (небелковые по своей природе) способные поглощать свет с заданной длиной волны и излучат его на другой длине волны. Это явление можно визуализировать и анализировать, используя флуоресцентный микроскоп или гель-док систему.

В результате чего красители часто используют для флуоресцентного мечения различных биомолекул (антител, пептидов, различных белков и т. д.) для таких процессов, как мониторинг доставки лекарств в ткани-мишени, визуализация и другие.

Реагент H₂DCFDA (2′,7′-Дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

HDCFDA представляет собой нефлуоресцирующее производное флуоресцеина — его восстановленную ацетилированную форму. Реагент начинает флуоресцировать только после отщепления ацетильных групп и окисления внутри клетки, превращаясь в 2′,7′-дихлорофлуоресцеин. Он характеризуется флуоресценцией в зеленой области спектра (максимум поглощения при 511 нм, максимум флуоресценции при 533 нм). Реагент подходит для исследования живых клеток и не совместим с фиксацией образцов.

Ацетильные группы в структуре HDCFDA повышают его липофильность и улучшают проникающую способность реагента через клеточную мембрану. Попадая внутрь клетки, он деацетилируется клеточными эстеразами, из-за чего приобретает заряд и лучше удерживается внутри клетки. Окисление активными формами кислорода приводит к образованию флуоресцирующего продукта — 2′,7′-дихлорофлуоресцеина и может быть детектировано различными способами, например, с помощью проточного цитометра, планшетного ридера или флуоресцентного микроскопа.


Информация для заказа:

Пока нет данных. Перейти в каталог
2247-100mg
2247-100mg
100 мг
По запросу
По запросу
2247-250 mg
250 мг
хранение -20°C в темноте, транспортировка комнатная температура
29 640, руб.

H₂DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат) —реагент для изучения продукции активных форм кислорода в живых клетках.

Общие свойства реагента H₂DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

  • Молекулярная масса – 487,29;
  • CAS-номер – 4091-99-0;
  • брутто-формула – C₂₄H₁₆Cl₂O₇;
  • название IUPAC – 2-(3,6-diacetyloxy-2,7-dichloro-9H-xanthen-9-yl)benzoic acid;
  • растворимость – хорошая в ДМСО, этаноле и ДМФА;
  • контроль качества – ЯМР 1H, ВЭЖХ-МС (95%);
  • условия транспортировки – до трех недель при комнатной температуре;
  • условия хранения – 12 месяцев с момента доставки при −20°C в темноте.

Берегите от влаги. Избегайте хранения на свету и излишних циклов заморозки-разморозки стокового раствора. При многократном использовании настоятельно рекомендуется хранить реагент в атмосфере сухого аргона.

Спектральные свойства реагента H2DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

  • Максимум возбуждения/поглощения, нм – 511;
  • ε, л⋅моль⁻¹⋅см⁻¹ – 118626
  • длина волны флуоресценции, нм – 533;
  • квантовый выход флуоресценции – 0,76;
  • CF260 – 0,17;
  • CF280 – 0,14.

Рекомендации по использованию реагента H2DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

  • Используйте свежеприготовленный раствор реагента (из-за постепенного окисления реагента рабочий раствор не предназначен для долговременного хранения).
  • Необходимо подобрать оптимальную рабочую концентрацию реагента и время инкубации, необходимое для деацетилирования и окисления реагента, для клеточной линии и условий эксперимента. Если для используемой клеточной линии нет рекомендуемых протоколов, начните с концентрации в диапазоне 1-10 мкМ и времени инкубации ~30 минут.
  • Не инкубируйте краситель с клетками в присутствии сыворотки, так как она содержит ферменты, расщепляющие H₂DCFDA.

Набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

Готовый набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических клеток с помощью Аннексина V, конъюгированного с AF488, и PI.

Методы использования набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

  • Окрашивание клеток:

    1. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.

    2. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7.4) и один раз 1х буфером для связывания.

    3. Ресуспензируйте клетки в холодном 1х буфере для связывания.

    4. Отберите 100 мкл суспензии клеток (от 1×10⁵ до 1×10⁶ клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями (см. описание контролей ниже).

    5. Добавьте 2-5 мкл раствора аннексина V-AF488 в каждую пробирку, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.

    6. Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.

    7. (Опционально) Добавьте 5 мкл йодистого пропидия в каждую пробирку с клетками. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
      Важно! Не промывайте клетки от йодистого пропидия. Йодистый пропидий должен оставаться в буфере во время сбора данных.

    8. Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.
      Важно! Количественное определение клеток методом проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии необходимо производить в течение 4 ч от начала окрашивания из-за негативного воздействия йодидистого пропидия на жизнеспособность клеток.


  • Проточная цитометрия:

    1. Для цитофлуориметрического анализа апоптоза и некроза клеток с помощью аннексина V-AF488 и йодистого пропидия помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли: неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); клетки, окрашенные только аннексином V-AF488, и клетки, окрашенные только йодистым пропидием (для настройки компенсации).

    2. Анализ связывания аннексина V-AF488 проводят с использованием детектора сигнала FITC.

    3. Анализ клеток, окрашенных йодистым пропидием, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.


  • Флуоресцентная микроскопия:

    1. Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.

    2. В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.

    3. (Опционально) Клетки после окрашивания аннексином V, перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF488, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.

    4. Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя двойной набор фильтров для FITC и родамина.


Информация для заказа:

Пока нет данных. Перейти в каталог
21172
50 тестов
хранение -20°C, транспортировка комнатная температура
27 746, руб.

Набор для определения апоптотических клеток содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических и некротических клеток с помощью аннексина V, конъюгированного с AF488, и йодистого пропидия.

AF488 — сульфированный родамин, яркий, фотостабильный и гидрофильный флуорофор. Краситель излучает в зеленом (FITC) канале.

  • Максимум поглощения, нм — 495;
  • максимум эмиссии, нм — 519.

Йодистый пропидий (PI) — непроницаемый через плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале.

  • Максимум поглощения, нм — 535;
  • максимум эмиссии, нм — 617.

Состав набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

  • Аннексин V, AF488 конъюгат, мкг – 5;
  • Propidium Iodide solution, 0,1 мг/мл, мкл – 100;
  • Annexin V Binding Buffer, 5x, мл – 15.

Условия транспортировки и хранения

  • Транспортировка – до трех недель при комнатной температуре;
  • хранение, °С – -20°С;
  • срок хранения – 12 месяцев.

Рекомендуемые концентрации аннексина V-AF488 — от 2 до 5 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Перед экспериментом необходимо опробовать разные разведения аннексина V-AF488 для определения оптимальной концентрации.

Окрашивание с помощью йодистого пропидия — опционально. Этот этап можно пропустить, если в задачах нет необходимости исследовать некроз.

Важно! Аннексин V можно использовать в качестве маркера апоптоза только в клетках с интактной плазматической мембраной. При нарушении целостности плазматической мембраны аннексин V может связываться с ФС внутри клетки и давать ложноположительный результат.


Применение набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488


Приготовление растворов

1. Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF488 в 250 мкл деионизованной воды.

Важно! Разведенный рекомбинантный белок необходимо хранить защищенным от света при температуре 2-8°C. В растворе конъюгат стабилен в течение месяца. При длительных экспериментах рекомендуется приготовить аликвоты и хранить их при температуре −20°С. Избегать повторного замораживания!

2. Приготовьте необходимый объём 1х буфера для связывания, смешав 1 часть 5х буфера для связывания с 4 частями деионизованной воды.


Окрашивание клеток

1. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.2. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7.4) и один раз 1х буфером для связывания.

3. Ресуспензируйте клетки в холодном 1х буфере для связывания.

4. Отберите 100 мкл суспензии клеток (от 1×105 до 1×106 клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями (см. описание контролей ниже).

5. Добавьте 2-5 мкл раствора аннексина V-AF488 в каждую пробирку, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.

6. Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.

7. (Опционально) Добавьте 5 мкл йодистого пропидия в каждую пробирку с клетками. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Важно! Не промывайте клетки от йодистого пропидия. Йодистый пропидий должен оставаться в буфере во время сбора данных.

8. Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.

Важно! Количественное определение клеток методом проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии необходимо производить в течение 4 ч от начала окрашивания из-за негативного воздействия йодидистого пропидия на жизнеспособность клеток.


Проточная цитометрия

1. Для цитофлуориметрического анализа апоптоза и некроза клеток с помощью аннексина V-AF488 и йодистого пропидия помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли: неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); клетки, окрашенные только аннексином V-AF488, и клетки, окрашенные только йодистым пропидием (для настройки компенсации).

2. Анализ связывания аннексина V-AF488 проводят с использованием детектора сигнала FITC.

3. Анализ клеток, окрашенных йодистым пропидием, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.


Флуоресцентная микроскопия

1. Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.

2. В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.

3. (Опционально) Клетки после окрашивания аннексином V, перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF488, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.

4. Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя двойной набор фильтров для FITC и родамина.


Результат окрашивания

  • Ранние апоптотические клетки, связавшие аннексин V-AF488, окрашиваются в зеленый цвет в плазматической мембране.
  • Некротические клетки в результате проникновения йодистого пропидия внутрь клетки будут окрашены красным.
  • Апоптотические клетки с нарушенной в результате вторичного некроза целостностью мембраны будут иметь красное окрашивание (йодистый пропидий) и ореол зеленого окрашивания (AF488) на клеточной поверхности (плазматическая мембрана).
  • Здоровые клетки будут лишены окрашивания.
  • Набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

См. также:

Антитела

Клеточные линии

Красители флуоресцентные

Планшетные (спектро) фотометры, флуориметры, люминометры автоматические

Проточные цитометры: анализаторы и сортеры

Ростовые факторы и цитокины

Системы визуализации биолюминесценции in vivo


Вам также может быть интересно:

Антитела и наборы для ИФА для любой области исследования! Обзор применения антител Arigobio

ИФА спектрофотомеры/фотометры, вошеры для планшетов, шейкеры производства Китай и США. На складе!

Проточный цитофлуориметр 7S (ZS-AE7S) для рутинных задач! BioSino, Китай

Флуоресцентные наборы для оценки пролиферации клеток

Исследования in vivo: визуализация, документирование, анализ. Newton, Vilber



Ниже вы можете задать вопрос или оставить запрос в свободной форме:

Раскрыть анкету для отправки запроса

Ваш заказ будет обработан
в ближайшее время.
Мы пришлем уведомление, как только все будет готово. Спасибо!