Специализированный набор TSAPlus предназначен для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания гистологических срезов, заключенных в парафин. Он позволяет эффективно визуализировать две различные мишени при использовании первичных антител, полученных от одного и того же вида животных, сохраняя при этом возможность работы с антителами из разных источников.
В основе метода лежит высокоэффективная технология амплификации тирамидного сигнала (TSA). В ходе каталитического цикла под воздействием пероксидазы хрена (HRP) и пероксида водорода (H₂O₂) происходит активация меченого тирамида с образованием реакционноспособных радикалов. Эти радикалы формируют устойчивые ковалентные связи с тирозиновыми остатками белков непосредственно в месте локализации антигена. Такой механизм обеспечивает многократное усиление интенсивности свечения за счет накопления плотного слоя флуорофоров в целевой зоне.
Комплект включает усовершенствованные флуоресцентные красители двух разных спектров iF488 (зеленый) и iF594 (красный), конъюгированные с тирамином. В сравнении с предыдущим поколением реагентов (серия G1235), данные красители обладают оптимизированными оптическими характеристиками: повышенной яркостью и улучшенной фото-стабильностью. Это гарантирует получение контрастных изображений и высокую чувствительность детекции при проведении мультиплексного анализа.
Технические характеристики набора
- Количество тестов — 50 или 100;
-
срок хранения набора составляет 12 месяцев при соблюдении соответствующих условий;
-
срок годности готового раствора — 24 часа.
Ниже приведены данные флуоресцентного спектра красителей, входящих в состав наборов для флуоресцентного окрашивания серии TSA
|
Тип флуоресцентного красителя
|
Длина волны возбуждения (Em), нм
|
Длина волны излучения (Em), нм
|
|
DAPI
|
359
|
457
|
|
iF440-Tyramide
|
434
|
480
|
|
iF488-Tyramide
|
491
|
516
|
|
iF546-Tyramide
|
541
|
557
|
|
iF555-Tyramide
|
557
|
570
|
|
iF594-Tyramide
|
588
|
604
|
|
iF647-Tyramide
|
656
|
670
|
|
iF700-Tyramide
|
690
|
713
|
Компоненты набора и условия хранения:
- iF488-Tyramide — 25 мкл (G1259-50T), 2×25 мкл (G1259-100T), хранить при -20 °C;
- iF594-Tyramide — 25 мкл (G1259-50T), 2×25 мкл (G1259-100T), хранить при -20 °C;
- разбавитель для тирамида — 100 мл (G1259-50T), 2×100 мл (G1259-100T), хранить при +4 °C;
- DAPI (готовый к использованию) — 10 мл (G1259-50T), 20 мл (G1259-100T), хранить при +4 °C;
- подавитель автоматической флуоресценции (Sudan Black B) — 10 мл (G1259-50T), 20 мл (G1259-100T), хранить при комнатной температуре;
- антифейд-монтажная среда — 5 мл (G1259-50T), 10 мл (G1259-100T), хранить при -20 °C;
- инструкция, шт. — 1.
Протокол использования:
- Предварительные шаги эксперимента:
- подготовить 0,01 М PBS-буфер (pH 7,0-7,4), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂;
- подготовить первичные антитела и соответствующие вторичные антитела, меченные HRP;
- подготовить раствор для восстановления антигена (используйте подходящий раствор в соответствии типу антител и ткани).
- Приготовление рабочего раствора TSA:
-
смешайте компоненты согласно таблице ниже:
|
Рабочий раствор TSA
|
Компоненты
|
Объем
|
|
TSA-488
|
Разбавитель для тирамида
|
1 мл
|
|
|
0,3% H₂O₂
|
10 мкл
|
|
|
iF488-Tyramide
|
2 мкл
|
|
TSA-594
|
Разбавитель для тирамида
|
1 мл
|
|
|
0,3% H₂O₂
|
10 мкл
|
|
|
iF594-Tyramide
|
2 мкл
|
Примечание: рабочий раствор TSA рекомендуется готовить непосредственно перед применением. Хранить его следует при +4 °C в защищенном от света месте, срок годности раствора — 24 часа.
Шаги протокола:
- депарафинизируйте срезы ткани до воды;
- проведите восстановление антигена (выберите подходящий метод в зависимости от типа ткани и антител);
- промойте ткань PBS 3 раза по 5 мин;
- блокируйте эндогенную пероксидазу 3% H₂O₂ в течение 25 мин при комнатной температуре в темноте;
- заблокируйте неспецифические сайты связывания 3% BSA или сывороткой в течение 30 мин;
- инкубируйте первичные антитела при 4 °C в течение ночи;
- инкубируйте вторичные антитела, меченные HRP, при комнатной температуре в течение 50 мин;
- добавьте рабочий раствор TSA-488 и инкубируйте 10 мин в темноте;
- проведите микроволновую обработку для удаления связанных антител;
- повторите шаги для второго первичного антитела и TSA-594;
- проведите контрастирование ядер DAPI;
- при необходимости проведите подавление автотоматической флуоресценции;
- закрепите срезы антифейд-монтажной средой и исследуйте под флуоресцентным микроскопом;
Примечания:
- концентрацию первичных антител рекомендуется снижать в 5-10 раз для уменьшения неспецифического фона;
- если фоновая флуоресценция слишком яркая, добавьте шаг подавления автоматической флуоресценции;
- рекомендуемое разведение флуоресцентного тирамида — 1:500 (диапазон 1:200-1:1000);
- для многоцветного мечения рекомендуется предварительно инкубировать поликлональные антитела, затем моноклональные.
