Спецпредложения | Оборудование, приборы | Пластик, стекло, принадлежности | Химические реактивы, препараты, наборы |
Предметный указатель | Библиотека | |||||||
![]() |
![]() Оптическая томография как доклинический метод визуализации процессов in vivo в организме мышей и крыс. Примеры применения Newton в исследованиях в онкологии, фармакологии, наномедицине (транскрибация вебинара от 4 апреля 2023 г.21.11.2023
Содержание статьи:
![]() Специалист «Диаэм» Анастасия Жирякова рассказала о технологии оптической томографии для визуализации биолюминесценции и флуоресценции in vivo, in vitro, ex vivo, ее аппаратном обеспечении от компании Vilber (Франция) и о примерах экспериментов, уже осуществленных с использованием этой технологии в области исследования процессов in vivo (онкогенез, миграция клеток, исследование динамика воспалительных и инфекционных процессов). Анастасия затронула темы перспектив применения Newton в доклинических исследованиях для оценки эффективности фармпрепаратов на мышах, возможностей программного обеспечения (атласа органов и костей, количественной оценки сигнала in vivo в динамике). ![]() История развития методаКомпания Vilber – французский производитель, с 1954 года работающий только в направлении УФ инструментов. ![]() Первые научные публикации, посвященные документированию мелких животных, были сделаны в 2011 г. на стандартных гель- и хемидокументирующих системах. Это натолкнуло производителя на мысль о необходимости более подходящей системы для выполнения таких задач. Так в 2016 г. появилась система Newton 7.0 mini, которая подключала систему анестезии: живая мышь спала в системе, а в это время можно было без проблем детектировать биолюминесценцию и флуоресценцию in vivo. ![]() В 2019 г. появилась система Newton 7.0 FT Series, ставшая предметом этого вебинара – в ней реализована технология 3D оптической томографии. Современная система визуализации позволяет документировать in vivo, in vitro, ex vivo биолюминесценцию, флуоресценцию с возможностью получить 3D-топографическое изображение исследуемого животного. Среди доклинических методов визуализации, применяемых сегодня в исследованиях, можно упомянуть следующие:
При рассмотрении системы Newton 7.0 FT Series речь пойдет об оптическом изображении. ![]() Преимущества и сфера применения системы Newton 7.0 FTПреимущества этого инструмента:
![]() Задачи, которые можно решить с использованием рассматриваемой системы:
Объектами исследования могут выступать:
![]() Примеры использования системы для визуализации биолюминесценции с использованием люциферазыОбласти применения данного метода – онкология, иммунология, наномедицина, вирусология, нейробиология. ![]() Например, в онкологии этот очень простой метод позволяет проводить мониторинг на протяжении всего заболевания. Он делает возможными неинвазивные исследования, в которых можно локализовать сигнал, получить количественную оценку, и при этом подопытное исследуемое животное остается живым. ![]() Исследование противоопухолевой активности препаратовРабота, представленная одним из научно-исследовательских институтов Японии, была связана с определением in vivo противоопухолевой активности локорегиональной терапии α-излучением (астат-211) с трастузумабом против перитонеального метастазирования (PM) рецептора эпидермального фактора роста человека 2-позитивного рака желудка (GC) у мышей. Для этого использовали мышей с упомянутым 2-позитивным раком желудка. Самкам мышей пятинедельного возраста за неделю до эксперимента вводили внутривенно трансфицированные люциферазой клетки N87/Luc. Через 10 минут после инъекции люциферина в течение 10 с фиксировалась биолюминесценция. Далее биолюминесценцию у этих мышей PMGC последовательно регистрировали в течение одной недели, и на следующем рисунке можно ознакомиться с результатами. ![]() Контрольной группе мышей вводили только PBS (фосфатно-солевой буфер). Второй группе вводили трастузумаб в PBS без иных добавок (немаркированный), и результатов практически не отмечено. Третьей группе вводили только астат-211 (в концентрации 1 мегабеккерель). Следующим двум группам вводили трастузумаб в сочетании с облучением (астат-211) в различной концентрации – 0.1 МБк и 1 МБк. Исследователи пришли к следующим выводам, сравнивая рост опухоли у мышей PMGC, которым вводили PBS, немаркированный трастузумаб, свободный астат-211 смесь трастузумаба в астатом-211 в концентрации 0.1 МБк: все упомянутые комбинации либо не дали результата, либо практически не привели к изменениям. А в последней группе (нижняя серия снимков), соответствующей сочетанию трастузумаба с астатом-211 в концентрации 1 МБк, видно, что через три недели сигнал уже не обнаруживался, через пять недель снижалась опухолевая нагрузка, а через семь недель опухоли уже не было видно. Так было сделано заключение, что сочетание астата-211 с трастузумабом специфично влияет на HER2-положительные GC клетки in vivo и таким образом ингибирует рост опухоли, улучшая выживаемость у мышей PMGC. ![]() Изучение колонизации бактерийСледующий пример представлен исследовательской лабораторией из Мексики. Агентом в нем также была люцифераза, а исследователи снимали биолюминесценцию и изучали колонизацию e. coli у мышей: оценивали динамику колонизации энтеротоксигенной кишечной палочки путем проведения биолюминесцентного трекинга. Для этого создали вектор pRMkluc с люциферазой. Стрептомицин-обработанным четырехнедельным BALB мышам внутрь брюшины инокулировали кишечную палочку К-12 в pRMkluc или К-12 в pBR322. Через 1 час после заражения снимали биолюминесцентный сигнал. Эта работа позволяла отследить бактерии и их прохождение через кишечник. E. coli на рисунке Б, не меченная люциферазой, не проявляла биолюминесцентного сигнала, тогда как e. coli, на которой был вектор с меткой, регистрируется биолюминесцентный сигнал в зоне инокуляции мыши. ![]() Далее исследователи наблюдали прохождение бактерий – кишечных патогенов – через кишечник, чтобы определить колонизацию в динамике. Брали два вида микроорганизмов – ETEC FMU073332 и e. coli К-12, вводили их стрептомицин-обработанным BALB/c мышам вместе с люциферином. Биолюминесцентный сигнал снимали в момент, когда проводили колонизацию исследуемыми бактериями, а затем через 48 и 120 часов. При этом наблюдали определенные сигналы биолюминесценции и разное распределение в кишечнике той или иной бактерии. Бактериальные биолюминесцентные сигналы в кишечнике остались у мыши А, а у мыши Б биолюминесцентные сигналы локализовались уже в слепой кишке. ![]() Затем мыши были умерщвлены, их кишечный тракт выделен полностью, начиная с пищевода. Снятие биолюминесцентного сигнала позволило сделать вывод о том, что с помощью биолюминесценции можно иметь представление о времени и пространстве локализации кишечной палочки, о ее метаболической активности, и что биолюминесцентные сигналы, испускаемые, например, на верхнем рисунке нашей бактерией, расположены именно в проксимальном отделе в подвздошной кишке. Так можно визуализировать взаимодействие хозяина и патогена у живых животных. ![]() Визуализация единичных клетокСледующий пример представлен научно-исследовательской лабораторией из Канады. Эта работа была посвящена визуализации каждой клетки и подбору условий наблюдения, для чего снимали экспозицию через 30 минут и через 2 минуты. Здесь использовали клетки линии рака молочной железы MDA MB, разработанной для экспрессии люциферазы светлячка. Разбавляли в концентрации примерно в 1 клетку на лунку в 96-луночном планшете в 100 мкл DMEM среды. Показано, что через 30 минут экспозиции при бининге 12х12 и апертуре объектива f/0.70 биолюминесцентное излучение сигнала увеличивается, но дает при этом очень насыщенный сигнал. А при экспозиции 2 минуты с бинингом 12х12 и широко открытой линзой сигнал улавливается идеально. ![]() Использование флуоресценции в исследованиях и мультиспектральные возможности методаПри переходе к рассмотрению возможностей регистрации флуоресцентного сигнала следует обратить внимание, что наилучшим проникновением в ткани обладает ИК свет. В частности, обнаружено, что длины волн от 650 до 900 нм более эффективно проходят через ткани, чем те, которые находятся в спектре видимого света ввиду высокой автофлуоресценции при видимом свете. ![]() Соответственно, ИК свет лучше использовать, чтобы понимать глубину проникновения, для исследований и формирования 3D-изображения. ![]() Следующий пример предоставлен компанией Nanobiotix (Франция), работающей в сфере наномедицины. Эта компания сейчас предлагает подход к изменению биораспределения лекарства в организме, основываясь на том, что любое вещество при попадании в наш организм после клиренса в первую очередь занимает клетки печени и лишь малая часть попадает в организм. При этом исследователи выдвинули идею о том, что если предварительно занять клетки печени, то изучаемое лекарство будет распределяться лучше и дойдет до зоны интереса. Для такого переопределения биодоступности в наномедицине был создан липосомальный нанополимер со специфическими физико-химическими свойствами. Этот нанополимер в виде раствора вводили в хвостовую вену мышей и затем снимали флуоресценцию в течение 1 часа с использованием системы Newton 7.0. Установлено, что в течение 10 минут после инъекции большая часть продукта накапливается в печени и только незначительная часть его остается в крови. ![]() На следующем этапе эксперимента взяли две линейки мышей. Одним также вкалывали в хвостовую вену только флуоресцентные наночастицы, другим –сначала нанополимер, а через 10 минут – наночастицы. При этом наблюдали за биораспределением вещества. В данном случае можно сделать вывод: изображение, полученное с помощью Newton 7.0, демонстрирует, что во втором случае способность нанопраймера увеличивает циркуляцию в крови наночастиц и влияет на характер их распределения, тогда как на верхних рисунках весь флуоресцентный агент все так же концентрируется в печени. ![]() В следующем примере изучали механизм переноса нагруженного доксорубицином наногеля на основе хитозана через кишечный эпителий. Использовали препарат Cy3-CS, FITC-CMCS и DOX:CS/CMCS-NGs. Использовали препарат Cy3-CS, FITC-CMCS и DOX:CS/CMCS-NGs. Исследование проводилось с целью понять механизм, связанный с транспортировкой этого комплекса через кишечный барьер. Внимание сосредоточили на клеточно-молекулярном механизме. Препарат был введен крысам перорально для изучения влияния в том числе кальция на поглощение этого препарата. В течение 8 часов детектировали флуоресцентный сигнал. Этот сигнал не наблюдался в случае, когда комплекс был связан с кальцием. На основании результатов наблюдения сделали вывод о том, что это связано с ослаблением способности кальция связывать DOX с последующим снижением поглощения этого комплекса. ![]() Затем животные были умерщвлены и проводилось ex vivo исследование на органах после 10 часов перорального приема этого препарата с кальцием и без кальция. Был сделан вывод, что флуоресцентный сигнал комплекса доксорубицина с кальцием в группе обнаруживается только в подвздошной кишке и желудке, а для группы животных, которым был введен препарат без кальция, флуоресцентный сигнал был явно больше в печени и почках, чем в подвздошной кишке. ![]() Оптическая 3D-томография и ее особенностиПоговорим о том, за счет чего при использовании метода 3D-оптической томографии можно получить непревзойденную точность и подробные результаты. Уже было сказано, что первые работы – in vivo исследования на мелких животных – проводились на обычных гель- и хемидокументирующих системах, на которых получали 2D-изображения. ![]() При этом у исследователей не было понимания глубины сигнала, результаты были приближенными, а значит, данные могли быть неверно истолкованы. При переходе к 3D-томографии сигнал реконструируется в объеме и перемещается в трехмерное представление мыши. За счет этого мы получаем более четкие сведения о локализации сигнала в теле животного и о его количественных характеристиках. Как же реализуется в Newton 7.0 3D-оптическая томография? ![]() В приборе есть 3D NIR-камеры, за счет которых исследователь получает 3D-представление о мыши – топографическое изображение, которое дальше будет использоваться. Затем основная CCD- камера получает несколько изображений сигнала с использованием различных эмиссионных фильтров с длинами волн в спектральном излучении люциферазы или введенных флуоресцентных молекулярных реагентов. Потом сигнал реконструируется с помощью определенного алгоритма и помещается на созданное топографическое изображение животного. ![]() Как это происходит? На движущейся картинке – трехмерном изображении животного – с помощью программного обеспечения можно выбрать, добавить или скрыть отдельные органы или кости: пользователь ставит галочку, «включая» определенные органы или кости на модели. Далее также можно создавать аксиальный, сагиттальный и корональный виды, чтобы оценить, где сосредоточен сигнал, и количественно определять этот сигнал в единицах объема с помощью программного обеспечения. ![]() Вот как устроена камера (темная комната) внутри у прибора Newton 7.0 FT: в ней есть моторизованная камера и линзы по Z-оси, макромодули, все это рассчитано на 5 мышей. По осям X/Y есть моторизированный подогреваемый столик, позволяющий быстро изменить расположение образца. По оси X есть моторизованные источники света. Эта уникальная технология сканирования позволяет облучать полностью всю поверхность исследуемого животного, при этом все двигается: можно непосредственно менять положение мыши в пространстве. Все это позволяет получить более точный количественный подсчет флуоресценции. ![]() Спектральные возможности системы Newton 7.0 FTПрибор обладает полным спектральным диапазоном – это 8 каналов возбуждения (от 400 нм до 800 нм), в нем есть мощная лазерная подсветка класса II, нет никакой перекрестной стимуляции за счет того, что используются узкополосные фильтры. Можно увеличить чувствительность для получения изображений. ![]() Программное обеспечение для системы Newton 7.0 FTСоответственно, современное программное обеспечение позволяет редактировать изображение, анализировать его. Снимать данные можно в автоматическом, ручном и последовательном режимах, можно накладывать изображения и получать видео. Это ПО поставляется в комплекте с системой. Среди других его возможностей следует отметить визуализацию изменения сигнала: изображения, которые получены во время различных сеансов, можно сгруппировать вместе, чтобы наблюдать последовательность, при этом можно построить временной ряд на основе изображений, полученных в разные дни эксперимента. ![]() Программное обеспечение позволяет исследователю собирать, сравнивать эти изображения и получать картинки на протяжении всего курса лечения – обычно животное живет полтора месяца. ![]() А затем можем воспользоваться режимом видеосъемки, когда последовательно снимаются много изображений и накладываются друг на друга – их можно просмотреть, как видео, сгруппировав соответствующим образом и выстроив с помощью ПО последовательность. В таком небольшом видеоролике будет видна динамика процесса – например, вы обратили внимание, как красным отмечено вещество, распределение которого изучается, и можно увидеть в созданной видеозаписи, как это вещество проходит по организму и где локализуется. Анализировать изображения можно путем сравнения нескольких участков. Результаты получаются в форматах .xls и .pdf нажатием одной кнопки, расчеты проводятся за секунду – в этом прибор очень удобен. ![]() На слайде приведены научные работы, которые уже были сделаны на системе Newton 7.0 FT. ![]() Варианты исполнения прибора и его стоимостьУ системы Newton 7.0 FT Series есть несколько линеек. Существуют приборы, дающие возможность работы с пятью мышами и одной мышью (Newton 7.0-FT100); есть система только для регистрации биолюминесценции (Newton 7.0-BT500) и система для регистрации как биолюминесценции, так и флуоресценции (Newton 7.0-FT500) – со всеми восемью источниками света и соответственно эмиссионными фильтрами. Кроме этих четырех моделей, есть еще одна, Newton 7.0 BIO-FT500 позволяющая работать с растениями: у нее несколько отличается организация темной комнаты, включающей платформу с ротацией – она позволяет поворачивать растение. Для примера: система Newton 7.0-FT500 для пяти мышей с регистрацией биолюминесценции и флуоресценции стоит 140 тыс. евро – по курсу на момент проведения вебинара это составляло 12 млн 658 тыс. рублей. В названную цену включено программное обеспечение и стоимость установки прибора, а также поддержка производителя: у «Диаэм» с ним прекрасный контакт, специалисты могут подключаться – есть доступ в реальном времени для решения каких-либо вопросов. ![]() Если сравнить с конкурентами…Следует обратить внимание, что системы от конкурирующих с Vilber производителей, представленные на рынке такого оборудования, включают рентген, тогда как система Newton – без рентгена. Ее производитель считает, что применение рентгенографии – это опасный метод, а потому предлагает технологию, которая дает отличные результаты без его использования, и этим стоит воспользоваться. Если сравнивать 3D-томографию с рентгенографией, то стоит помнить, что это в принципе разные технологии визуализации, как, например, МРТ и КТ. Исследователь наблюдает визуализацию биолюминесцентной или флуоресцентной метки. При этом есть определенные ограничения для работы с головным мозгом, связанные с черепными костями как барьером. В то же время рентген – это облучение, при этом в ряде задач рентгеновские снимки не покажут какие-то детали, например, не позволит досконально изучить сосудистую систему, отдельную клетку, посмотреть ex vivo результаты. На рентгене вы можете увидеть опухоль или изменение ее размера с течением времени. С использованием же флуоресцентной метки можно отследить динамику, оценить молекулярные механизмы, тонко изучить локализацию, как мы наблюдали в экспериментах с кишечником. Оптическая томография позволяет больше увидеть и понять, в 3D отображении понять локализацию чего-либо в мягких тканях, оценить размер. Программное обеспечение позволяет проводить количественную оценку, получить сравнительную характеристику: например, на протяжении определенного времени можно измерять сигнал у одного объекта и получать количественный подсчет данных. По сравнению с этой технологией у рентгена намного более ограниченный спектр задач, как и у КТ. Кроме того, у рентгеновских установок есть определенные ограничения по помещениям, где их можно использовать, в то время как оборудование Newton можно установить и использовать в любой лаборатории. Да и излучение при получении рентгеновских снимков – это дополнительная нагрузка на здоровье животного, особенно с учетом того, сколько снимков необходимо сделать при длительном эксперименте для получения данных в динамике. Впечатляет и сравнение уровня цен. Например, единственная известная докладчику система с рентгенографией и 2D-оптической визуализацией от PerkinElmer уже 2 года назад в России стоила порядка 30 млн. рублей, то есть при существенно большей цене уровень безопасности и точности представления ощутимо ниже. Все дополнительные вопросы о системе Newtom 7.0 FT от Vilber можно задать Анастасии Жиряковой по телефону 8-910-732-44-12 или по электронной почте az@dia-m.ru. Новость о вебинаре «Оптическая томография как доклинический метод визуализации процессов in vivo в организме мышей и крыс. Примеры применения Newton в исследованиях в онкологии, фармакологии, наномедицине». |
С помощью личного кабинета Вы сможете: