Спецпредложения | Оборудование, приборы | Пластик, стекло, принадлежности | Химические реактивы, препараты, наборы |
Предметный указатель | Библиотека | |||||||
![]() |
![]() Основы количественной и цифровой ПЦР. Применение в практике. Подходы к выбору технологии и реактивов. Часть 4. Цифровая ПЦР. С точностью «до молекулы»05.10.2021
![]() Идея цифровой ПЦР появилась буквально через пару лет после того, как был открыт сам метод ПЦР. В 1985-6 г опубликована первая статья, описывающая принцип цПЦР. Суть его заключалась в том, что реакционную смесь из пробирки с образцом следует раститровать на такое количество пробирок, чтобы в каждой было по одной нуклеиновой кислоте. Потом содержимое пробирок амплифицируется, после чего анализируется результат. Эта концепция цифровой ПЦР впоследствии эволюционировала. В 2005-6 гг. компания Fluidigm (и она была не единственной) вышла на рынок с первым прибором для цифровой ПЦР. «В массы» эти новинки не пошли примерно до 2009-10 г., когда уже BIO-RAD вышла на рынок со своим прибором. Определение цифровой ПЦРИтак, цПЦР – это аналитическая техника определения концентрации нуклеиновых кислот, основанная на ПЦР-амплификации единичных молекул образца без использования стандартов, если это количественная оценка. ![]() Имеющийся образец определенным образом разносится на определенное количество лунок – их можно назвать микрореакторами. У разных производителей реализация разная, но важно, чтобы в каждом микрореакторе оказалось по одной молекуле. Далее происходит амплификация и в конечном итоге чтение результатов и анализ на выходе. По сути это детекция флуоресценции по конечной точке, где можно увидеть положительные и отрицательные точки. Вся цифровая ПЦР описывается статистикой и моделью Пуассона. В среднем в каждой лунке находится по одной нуклеиновой кислоте. В каком-то случае в одну ячейку попадет и по две, и по три молекулы. Главное – чтобы были «отрицательные» лунки, которые позволяют сформировать модель. И при этом следует понимать, что большинство из них будет содержать все-таки по одной молекуле. Таким образом при амплификации достигаются наиболее высокие чувствительность, специфичность и точность цПЦР. Фотография отображает чип с положительными и отрицательными результатами: есть амплифицированные и неамплифицированные ячейки. На основании полученных данных программа рассчитывает количество нуклеиновой кислоты, которое было в реакции. Количество копий на реакцию фиксировано: Thermo Fisher рекомендует от 1 до 39. Все методики расчета и применения метода описаны в мануале за одним большим исключением: вся цифровая ПЦР на сегодня в первую очередь адаптирована только под геномные задачи и в первую очередь под человеческий геном. Это особенно связано с онкологией. Поэтому, если проводить цифровую ПЦР предстоит на каком-то другом образце (в качестве исходного материала выступает не человеческий геном), пользователю придется несколько адаптировать свою систему и произвести перерасчеты. Например, если речь об исследовании каких-то инфекций на фоне человеческой ДНК. Если материал чистый – с ним работать проще. Так или иначе, систему придется адаптировать под организм, с которым планирует работать пользователь. Оборудование для цПЦР от Thermo Fisher
Пользователь, который ее приобретает, сразу получает:
В отличие от прибора производства BIO-RAD, «термофишеровский» прибор калибровки не требует. У прибора три канала: FAM, VIC и ROX, но третий «роксовый» канал –нерабочий, технический. МастерМикс содержит референсный краситель ROX, по нему прибор оценивает заполняемость чипа (насколько хорошо заполнение произошло). ![]() Преимущества цифровой ПЦРВ первую очередь – определение концентрации. В данном случае цифровая ПЦР не зависит от значения контроля, а напрямую показывает результат. Во-вторых, цПЦР позволяет детектировать единичные молекулы матрицы даже при низкой концентрации. Собственно, идея цифровой ПЦР в этом и заключается, чтобы выловить именно эти единичные молекулы, которые на фоне «дикого» типа не будут амплифицироваться. Если взять пробирку с мутантной молекулой и «общую», проанализировать в «реалтайм» и цПЦР, разница будет существенна: в «реал-тайм» есть риск не увидеть сигнал от искомой молекулы. А в цифровой ПЦР результаты будут одинаковы, так как для амплификации каждой молекулы будут использоваться одинаковые условия. Цифровая ПЦР не нуждается в количественных стандартах для получения количественных результатов. Она сама по себе разу же автоматически их выдает. Более того, цифровая ПЦР является инструментом, который позволяет производить эти количественные стандарты для «реал-тайма». При этом не требуется никакой стандартной кривой, на экране прибора видятся количественные значения сразу же. «ЗА» и «ПРОТИВ» для двух методов
В цПЦР не нужно стандартов, эффективность ПЦР влияет на результат в меньшей степени – в первую очередь с точки зрения присутствия ингибиторов. При использовании этого метода происходит подсчет точного числа молекул, присутствующих в образце. Важно понимать, что подменять эти понятия, как делают многие наши конкуренты, нельзя: цПЦР никогда не заменит «реал-тайм». Но расширяет возможности последнего. То, что нельзя делать «реал-таймом», можно достичь цифровой ПЦР. Но если что-то может цПЦР, и «реал-тайм», то «реал-тайм» будет дешевле примерно на порядок. Если есть сложные матрицы и сложные образцы с минимальным количеством образца, то нужно задействовать цифровую ПЦР. Практика показывает что необходимость цПЦР составляет 1-25, максимум 30 образцов из всего пула образцов, с которыми приходится работать, а в среднем это 10-15 образцов, которые придется анализировать с использованием цПЦР, поскольку они не укладываются в общую картину с «реал-тайм». Это касается в первую очередь экспрессии, может быть, экспрессии единичных клеток, там можно использовать цПЦР. Таких лабораторий мало. В первую очередь это некая рутина, копийность, это экспрессия. Но опять же этих вещей, которых нельзя достичь «реал-таймом», очень мало, однако они все же существуют. Процессы в цПЦР
Процедура включает 4 шага:
Важный момент: получается запечатанная система. Чип запечатывается напрочь и уже не открывается в процессе чтения. Это не свойственно, например, для «биорадовской» системы, у которой по окончании процесса проточный цитометр прокалывает стрипы или плашку, запечатанную пленкой, забирает оттуда образец, анализирует его. Это приводит к риску контаминации помещения, где проводится анализ. Известны случаи такой контаминации лабораторий биорадовской машиной. В связи с этим проточный цитометр рекомендуют ставить отдельно – например, в зоне, где производится электрофорез, чтобы свести к минимуму последствия контаминации. С оборудованием Thermo Fisher этого не происходит: образец остается запечатанным и потом выбрасывается, поскольку он после анализа уже в принципе не нужен. Основные приложения для цифровой ПЦР
Но! Если вы обнаруживаете какую-то мутацию, которая не обнаружена, то можно использовать капиллярный электрофорез, а в случае, если и его чувствительности не хватает, стоит переходить к цифровой ПЦР. Но опять-таки на сегодня наша система NGS и наши решения для NGS позволяют детектировать 0,1 процента мутаций. Так что чувствительность NGS на сегодня подошла к чувствительности цПЦР. Но возвращаясь к первому слайду, отметим: в случае одного образца и одной мутации запускать NGS нецелесообразно. Можно запустить цПЦР. Или реалтайм. Правда, его чувствительности может не хватит. Поэтому придется запускать NGS. Вообще чувствительность такова, что можно «вылавливать» и еще меньшие количества. Вопрос: является ли это действительно решением или это некий артефакт? Прибор видит просто точку, но нужна некая статистика, чтобы понять, реально это мутация или нет?
|
С помощью личного кабинета Вы сможете: