Нанопоровое секвенирование: примеры применения технологии Oxford Nanopore Technologies

Представляем обзор свежих публикаций о применении технологии нанопорового секвенирования Oxford Nanopore Technologies: сборка бактериальных геномов, выявление генов лекарственной устойчивости у бактерий, анализ эволюционирования вирусов и многое другое. Oxford Nanopore Distributor logo (1).jpg
17.09.2018

28.08.2018

18.08.2018

10.08.2018


Судьба мРНК в семенах — сохранение, разрушение или медленный распад
17.09.2018

Семена — наиболее незащищённая часть растения, поскольку в них нет системы восстановления вследствие химической деградации, что ведёт в конечном счёте к гибели семян. Старение семян затрагивает все биомолекулы, а деградация РНК идёт в сухих семенах при хранении параллельно с потерей жизнеспособности. Был проанализирован транскриптом соевых бобов (Glycine max) с целью выявить специфические изменения в мРНК. Для этого использовалась технология прямого секвенирования РНК. Выявлена значительная фрагментация транскриптов в семенах при хранении (23-летние бобы по сравнению с 2-летними). Фрагментация происходит случайным образом, при этом более длинные транскрипты фрагментируются сильнее. Это подтверждает предположение о том, что механизм деградации РНК связан с атакой свободных радикалов на случайные нуклеотиды. Целостность коротких транскриптов не предотвращает гибель семян, что говорит о том, что функций этих коротких транскриптов недостаточно для сохранения жизнеспособности. Таким образом, при хранении семян необходимо оценивать степень деградации РНК как критерий их всхожести.

Exploring the fate of mRNA in aging seeds: protection, destruction, or slow decay?
_____________________________________________________________________________________________________

Генетический базис полиморфизма окраски у божьих коровок Harmonia axyridis
17.09.2018

У многих видов живых организмов наблюдается разнообразие фенотипических форм. Пример таких организмов — насекомые, у которых имеет место полиморфизм окраски в рамках одного вида, например, меланизм — фенотип с тёмной окраской. Но генетические механизмы этой полиморфности изучены слабо. У многих видов божьих коровок (Coccinellidae) в рамках одного вида может сильно варьировать узор из красных и чёрных пятен, в частности, у Harmonia axyridis встречается более 200 вариантов окраски. Классический генетический подход предполагает, что это следствие аллельных вариаций одного неизвестного локуса. Исследователи объединили геномное секвенирование (на платформах Oxford Nanopore и Illumina), полногеномный поиск ассоциаций в популяциях, анализ экспрессии генов и функциональный анализ генов и установили, что полиморфизм окраски у H. axyridis контролируется транскрипционным фактором pannier. Этот фактор необходим для формирования тёмных пятен на надкрыльях. Многообразие окраски возникает за счёт цис-регуляторных элементов в одном-единственном гене.

The Genomic Basis of Color Pattern Polymorphism in the Harlequin Ladybird
_____________________________________________________________________________________________________

Структурный и функциональный анализ генов транспорта мальтозы в дрожжах Saccharomyces eubayanus CBS 12357T
17.09.2018

Пивные дрожжи низового брожения Saccharomyces pastorianus — это гибрид Saccharomyces cerevisiae и холодостойкого вида Saccharomyces eubayanus. Исследование генов транспорта мальтозы предназначено для понимания того, какой вклад в метаболизм мальтозы вносит геном каждого из предков. При секвенировании на MinION (Oxford Nanopore Technologies) были получены длинные риды, позволившие получить сборки всех 16 хромосом (кроме 12) в виде единичных контигов. Были секвенированы с высоким разрешением 4 локуса, в которых находятся гены транспорта мальтозы. Характеризация транспорта мальтозы в дрожжах на геномном уровне важна для пивной промышленности.

Structural, Physiological and Regulatory Analysis of Maltose Transporter Genes in Saccharomyces eubayanus CBS 12357T
____________________________________________________________________________________________________

МКС.jpg

Секвенирование РНК в космосе
17.09.2018

В конце августа 2018 года впервые в космосе была успешно секвенирована РНК.

Секвенирование проводилось на борту МКС с помощью нанопорового секвенатора MinION, позволяющего чтение последовательности РНК напрямую, без обратной транскрипции. Ранее на МКС проводилось секвенирование ДНК с целью анализа микробиома на борту МКС. Подобные исследования необходимы для мониторинга микрофлоры на космической станции, биомедицинских экспериментов в условиях микрогравитации, и, теоретически, для обнаружения внеземной жизни в космосе.

https://nanoporetech.com/about-us/news/international-space-station-update-direct-rna-sequencing-space
____________________________________________________________________________________________________

Быстрая диагностика инфекций нижних дыхательных путей с помощью метагеномного секвенирования по нанопоровой технологии
28.08.2018

Золотой стандарт микробиологических исследований при инфекциях нижних дыхательных путей — это культивирование патогена. Данный метод из-за низкой специфичности и временных затрат не позволяет начать антибиотикотерапию на ранних стадиях заболевания. Метагеномный анализ позволяет получить быстрый и более точный результат и способен заменить метод культивирования.

Разработана методика метагеномного анализа при бактериологических исследованиях инфекций нижних дыхательных путей. В основе методики — удаление хозяйской ДНК из образца и нанопоровое секвенирование. После тестирования и отладки методики на образцах, полученных от пациентов, выявлено совпадение на 96,6% с результатами, полученными на бактериальных культурах. Время, затраченное на выявление генов резистентности, составило 6 часов.

Показано, что нанопоровое метагеномное секвенирование позволяет быстро и точно охарактеризовать возбудителя инфекции нижних дыхательных путей при условии элиминации ДНК пациента из образца.

Rapid Diagnosis of Lower Respiratory Infection using Nanopore-based Clinical Metagenomics _____________________________________________________________________________________________________

Разработка и тестирование с помощью MinION таргетной панели секвенирования при хронической лимфоцитарной лейкемии
28.08.2018

Разработана таргетная панель, предназначенная для секвенирования по технологии третьего поколения (нанопорового секвенирования на MinION) 5 генов, мутации в которых связаны с хронической лифоцитарной лейкемией. Это гены TP53, NOTCH1, BIRC3, SF3B1 и MYD88. Получение библиотеки для секвенирования основано на мультиплексной амплификации длинных фрагментов (long-range).

При тестировании методики параллельно проводилось секвенирование по Сэнгеру.

Картирование проводилось с помощью референсного генома GRCh37. Среднее значение глубины покрытия для коротких ампликонов было выше, конечная глубина покрытия панели составила 94,1%. Частота ошибок равнялась 6% для инсерций/делеций и 2% для точечных замен. В итоге оказалось достаточно поставить всего 2 ПЦР для анализа связанных с лимфолейкозом генов одного пациента.

Данная стратегия представляет собой быстрый и эффективный способ таргетного секвенирования, и в дальнейшем требуется только повышение точности.

Design and MinION testing of a nanopore targeted gene sequencing panel for chronic lymphocytic leukemia _____________________________________________________________________________________________________

Картирование точек разрыва транслокации t(X;20)(q11.1;p13) с помощью позиционного клонирования и секвенирования длинных фрагментов
28.08.2018

При болезнях, связанных с хромосомными перестройками, точки разрыва находятся или внутри гена, связанного с заболеванием, или в его ближайшем окружении. Транслокация t(X;20)(q11.1;p13) была ранее охарактеризована G-окрашиванием и FISH. Её точное картирование было осуществлено с помощью позиционного BAC-клонирования и полногеномного секвенирования по нанопоровой технологии с 1.46-кратным покрытием. Анализ длинных ридов химерных последовательностей, состоящих из фрагментов 20 и Х-хромосом, позволил идентифицировать точки разрыва во 2 интроне гена ARHGEF9 в локусе Xp11.1 и между генами RASSF2 и SLC23A2 в локусе 20р13.

Это первое сообщение об успешном картировании транслокации с разрешением в 1 пару нуклеотидов, полученном с помощью нанопорового секвенирования.

Breakpoint mapping of a novel de novo translocation t(X;20)(q11.1;p13) by positional cloning and long read sequencing _____________________________________________________________________________________________________

Заполнение пробелов в последовательностях растительных геномов с помощью нанопорового секвенирования
28.08.2018

Первым растением, чей геном был полностью секвенирован и собран, стал Arabidopsis thaliana. Это заняло 10 лет, было завершено в 2000 году и стоило около 100 млн. долларов. Сейчас, благодаря технологии нанопорового секвенирования, подобная работа может быть проделана за несколько дней, и её стоимость составит несколько тысяч долларов.

Нанопоровое секвенирование, дающее длинные риды, имеет ряд преимуществ перед NGS, дающим короткие риды. Одно из этих преимуществ — более простая сборка генома, что даёт возможность исследовать ранее не изученные геномы растений и получить новую информацию об эволюции и скрещивании. На данный момент секвенирован геном только 225 видов растений из 400 000 известных, что составляет всего 0,06%.

Особенно востребована нанопоровая технология при характеризации генетического разнообразия в банках семян или при работе с трансгенными линиями. Новая платформа нанопоровых секвенаторов PromethION, позволяющая получать до 15 Тб за 48 часов, отвечает запросам исследователей, занимающихся секвенированием растений. На данный момент ведутся работы по секвенированию с помощью MinION и PromethION геномов различных сортов бананов, капусты, тюльпанов, тикового дерева и др.

_____________________________________________________________________________________________________

Преимущества нанопорового секвенирования при изучении микробиомов
18.08.2018

Изучение микробиомов — суммарного генетического материала сообщества микроорганизмов из биологических образцов — в последнее время притягивает всё больше внимания, в первую очередь, из-за того что микрофлора наших организмов и окружающей среды имеет большое влияние на наше здоровье.

Состав человеческого микробиома оказывает влияние на иммунный статус, ожирение, психическое состояние и т.д. Кроме того, наблюдается рост исследований микробиома окружающей среды, воды, почвы, зданий и т.д.

Классический подход изучения микробиома заключается в культивировании микроорганизмов, что требует значительных затрат времени, а результат зависит от индивидуальной способности того или иного микроорганизма к росту в лабораторных условиях. Появление технологий секвенирования позволило существенно продвинуться в данной области. Возросла скорость и точность анализа микробиома, поскольку культивирование больше не требуется. Тем не менее, традиционные методы секвенирования не решают некоторых проблем, с большинством которых способно справиться нанопоровое секвенирование...

https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/NAN100043_Microbiome_White_Paper_020818_ml_DIGITAL.pdf _____________________________________________________________________________________________________

Прямое секвенирование РНК с помощью нанопоровой технологии меняет взгляды на транскрипционную сложность вирусов
18.08.2018

Вирусные геномы обладают более высокой плотностью генов и более диверсифицированным транскриптомом по сравнению с хозяйскими клетками. Кодирующий потенциал вирусного генома максимизирован благодаря следующим особенностям: многочисленным рамкам считывания, локализации генов на противоположных цепях нуклеиновой кислоты, нетипичному использованию сигналов терминации и различным вариантам альтернативного сплайсинга. Как следствие — затруднена детальная характеризация вирусных транскриптомов традиционными методами.

Секвенирование полноразмерной нативной вирусной РНК с помощью нанопоровой технологии является решением этой задачи. Транскрипты могут быть секвенированы напрямую без обратной транскрипции и амплификации, необходимых при других технологиях секвенирования. Прямое секвенирование РНК позволяет детектировать варианты сплайсинга, альтернативные сайты инициации и терминации транскрипции и различные модификации РНК. В данной работе секвенирование нативной РНК использовалось для транскриптомного профилирования вируса простого герпеса 1 типа на ранних и поздних стадиях инфицирования первичных клеток.

Продемонстрирована эффектиность прямого секвенирования РНК и идентифицирован новый класс межгенных транскриптов, включающих мРНК, накапливающихся на поздних стадиях герпеса и кодирующих фьюжн из вирусной убиквитинлигазы ICP0 и вирусного мембранного гликопротеина L.

Native RNA sequencing on nanopore arrays redefines the transcriptional complexity of a viral pathogen
_____________________________________________________________________________________________________

Принципы и алгоритм детекции низкокопийных ДНК с помощью секвенатора и компьютера карманного формата
18.08.2018

Детекция конкретных молекул ДНК, слабо представленных в образце, представляет важную проблему при эпидемиологических и полевых исследованиях, поскольку такие образцы загрязнены нецелевыми ДНК. Все методы очистки образцов от примесей нецелевых ДНК требуют материальных и временных затрат. Нанопоровое секвенирование с помощью портативного секвенатора MinION, Oxford Nanopore Technologies позволяет избежать этих затрат и анализировать последовательность только целевых ДНК. Принцип технологии состоит в инвертировании напряжения при вхождении нецелевой молекулы ДНК в нанопору, что приводит к её выходу из поры. Однако, остаются технические проблемы, например, ограниченность компьютерных ресурсов в полевых условиях. Также требуются алгоритмы для быстрой онлайн-классификации ридов и разработка теоретической базы для модели селективного секвенирования.

В данной работе описывается статистическая модель для селективного секвенирования, предлагаемая в качестве классификатора базового профиля ДНК. Продемонстрировано, что метод позволяет селективно секвенировать с 500-кратным покрытием область длиной 100 тыс п.н., составляющую 0,1% от всего пула ДНК. Алгоритм позволяет обрабатывать 26 последовательностей в секунду с помощью недорого портативного компьютера на основе IntelCore i7 и не требует высокопроизводительных расчётов или дополнительного графического процессора. Затем эффективность метода показана на смеси ДНК фага лямбда и Saccharomyces cerevisiae. Фрагмент 1 хромосомы дрожжей длиной 200 тыс п.н. составлял 0,1% от всего образца и был селективно секвенирован с 30-кратным покрытием.

Алгоритм позволяет селективно секвенировать таргетную последовательность из всего пула ДНК, а также менять таргетный регион в ходе секвенирования.

A framework and an algorithm to detect low-abundance DNA by a handy sequencer and a palm-sized computer
_____________________________________________________________________________________________________

bacteria-3d-render.jpg

Интегративный конъюгативный элемент clc из штамма JB2 Pseudomonas aeruginosa
18.08.2018

Интегративные конъюгативные элементы (ИКЭ) — группа самопереносящихся мобильных генетических элементов, интегрирующихся в хромосому. Эти элементы активно влияют на функционирование бактерий и бактериальных сообществ. Каждый тип ИКЭ обладает специфическим набором базовых генов, ответственных за поддержку и перенос элемента, и набором карго-генов, влияющих на хозяйский фенотип с целью адаптации бактерии. Важная область, в которой ИКЭ проявляют себя, биодеградация ксенобиотиков. В данной области лучше всего охарактеризованы clc-ИКЭ. Карго-гены этих элементов ответственны за орто-расщепление хлорокатехолов (гены clc) и метаболизм аминофенолов (гены amn). Впервые этот элемент был идентифицирован у Pseudomonas knackmussii B13, утилизирующей 3-хлорбензоат, и у Burkholderia xenovorans LB400. При секвенировании генома Pseudomonas aeruginosa JB2, расщепляющей о-хлорбензоат, идентифицирован новый представитель clc-ИКЭ - clc-JB2. Карго-набор clc-JB2 отличается от clc-B13 и clc-LB400 комбинацией генов, кодирующих расщепление о-галогенбензоатов и о-гидроксибензоата в качестве субстратов. Эти гены представлены в виде тандемных повторов. Также у clc-JB2 отсутствует оперон регулирующих генов, контролирующий вырезание генов. Таким образом, механизм внутриклеточного поведения этого элемента отличается от других. Вырезание тандемных повторов снижает приспособляемость бактерии, но усечённая версия clc-JB2 может включать в себя другие гены, могущие оказаться полезными в плане адаптации.

The Integrative Conjugative Element clc (ICEclc) of Pseudomonas aeruginosa JB2 _____________________________________________________________________________________________________

Идентификация энхансерных центров и контактов между петлями в одноаллельных топологических структурах ДНК
18.08.2018

Фолдинг хроматина регулирует геномные процессы, в том числе активность генов. Существующие методы исследования конформаций характеризуют топологию генома с помощью анализа парных контактов в хроматине клеточной популяции, но не могут выявить конкурентный или кооперативный характер индивидуальных взаимодействий. В данной работе представлен метод мультиконтактного секвенирования 4С (МС-4С) — исследование конформаций ДНК в индивидуальных аллелях с помощью нанопорового секвенирования.

МС-4С различает кооперативные, случайные и конкурентные взаимодействия в ДНК и идентифицирует ранее неизвестные структуры в клеточных субпопуляциях. Отдельные элементы суперэнхансера гена b-глобина объединяются в энхансерный центр, регулирующий сходным образом два гена. Соседние петли хроматина формируют розеткоподобную структуру посредством соприкосновения их CTCF-связывающих якорных элементов. Изучение топологии индивидуальных аллелей помогает в понимании механизмов фолдинга и функционирования генома...

Enhancer hubs and loop collisions identified from single-allele topologies
_____________________________________________________________________________________________________

Новые инструменты для исследования влияния питания на микрофлору: нанопоровое секвенирование метагенома из содержимого желудка при изучении влияния питания на количественный состав микрофлоры у инвазивной популяции крыс
10.08.2018

Инвазивные виды представляют собой катастрофическую проблему для нативных популяций. Изучение особенностей питания этих видов является фундаментальной основой для понимания их воздействия на окружение и экосистему в целом. В дальнейшем полученная информация пригодится для контролирования ситуации.

Предыдущие методы исследования особенностей питания включали в себя визуальное обследование, анализ стабильных изотопов, замедленную видеосъёмку и ДНК-метабаркодинг. Но при применении всех этих методов возникали проблемы.

Показано, что метагеномное нанопоровое секвенирование позволяет быстро проанализировать профиль питания и даёт возможность точной локализации места обитания особи крысы в пределах десятков километров.

New tools for diet analyses: nanopore sequencing of metagenomic DNA from stomach contents to quantify diet in an invasive population of rats.
William Pearman, Adam N. H. Smith, Georgia Breckell, James Dale, Nikki E. Freed, Olin K. Silander.
_____________________________________________________________________________________________________

Точное определение последовательности генома Fusobacterium путём секвенирования с помощью MinION и Illumina
10.08.2018

Механизм вирулентности человеческих патогенов из рода Fusobacterium остаётся неясным из-за отсутствия правильно собранных и аннотированных геномов. В статье сообщается о полностью собранных геномах семи штаммов фузобактерий, а также приводятся данные по ресеквенированию референсного штамма Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586 (в общей сложности 7 видов, 8 геномов).

Высокопроизводительное и эффективное с точки зрения затрат мультиплексное секвенирование было осуществлено на платформах Illumina (короткие прочтения по 150 п.н.) и Oxford Nanopore MinION (длинные прочтения свыше 80 тыс.п.н.), сборка генома производилась c помощью открытого ПО Unicycler. По сравнению с предыдущими сборками (от 24 до 67 контигов) полученные геномы характеризуются высокой точностью и состоят из одной полной хромосомы. В статье представлена полная последовательность генома Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 23726. Это понятный с точки зрения генетики и важный с биомедицинской точки зрения штамм. Также было выяснено, что предыдущая геномная сборка Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586 содержит инверсию длиной 452 тыс. п.н., что скорректировано благодаря описанной методике секвенирования и сборки.

Чтобы сделать геномный анализ фузобактерий доступным для научного сообщества, был запущен FusoPortal — интерактивное хранилище для данных по генетике фузобактерий — результатов секвенирования, геномных карт, аннотаций к генам и функционального анализа белков. Ресурс FusoPortal облегчит идентификацию белков, ответственных за вирулентность Fusobacterium и связанных с патогенезом периодонтита, преждевременных родов и рака толстого кишечника.

Fusobacterium Genomics Using MinION and Illumina Sequencing Enables Genome Completion and Correction.
S. Michelle Todd, Robert E. Settlage, Kevin K. Lahmers, Daniel J. Slade.
_____________________________________________________________________________________________________

Стратегия сборки бактериальных геномов с помощью длинных ридов, получаемых при секвенировании на MinION
10.08.2018

Технологии секвенирования с получением коротких ридов сделали чтение генома микроорганизмов простым и дешёвым. Однако секвенирование кольцевых геномов часто требует больших затрат. Кроме того, сборка генома из коротких ридов может стать проблемой в случае повторов и GC-богатых структур. Технология, используемая в секвенаторе MinION, Oxford Nanopore, позволяет секвенировать одиночные молекулы ДНК неограниченной длины и решить вышеописанные проблемы (хотя весь потенциал этой технологии пока не раскрыт). В статье приводятся результаты секвенирования 9 бактериальных геномов, отличающихся GC-составом, полученных с помощью MiSeq, Illumina и MinION, Oxford Nanopore. Секвенирование с помощью двух различных технологий проводилось с целью выявления преимуществ каждой из них, а также возможности использования их сочетания. Геном, собранный из ридов, полученных только на MiSeq, отличается высокой точностью, но возникают проблемы с его целостностью. Эти проблемы могут быть решены с помощью длинных ридов, получаемых на MinION. Длинные риды MinION дают возможность получения длинных контигов, но в них будут ошибки и требуется процедура, называемая polishing, или отладка — уточнение последовательности, как правило, с помощью специального ПО. Наиболее это выражено, когда библиотеки Illumina отличаются одна от другой, например, в случае ДНК с разным GC-составом. Протяжённые контиги важны для идентификации длинных вставок и кластеров генов, ответственных за биосинтез вторичных метаболитов. Только с помощью длинных ридов можно однозначно интерпретировать подобные кластеры, богатые повторами.

Подводя итоги, можно сказать, что сборка генома из коротких ридов осложнена в случае повторов и GC-богатых структур. Результаты данной работы показывают, что эти сложности могут быть преодолены с помощью длинных ридов, получаемых при нанопоровом секвенировании. Таким образом, собранные из длинных ридов последовательности затем подвергаются отладке с помощью данных секвенирования на Illumina. Cочетание двух технологий секвенирования — Illumina и Oxford Nanopore — наиболее эффективно для секвенирования при изучении эволюции микроорганизмов.

Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing.
Sarah Goldstein, Lidia Beka, Joerg Graf, View ORCID ProfileJonathan Klassen.
_____________________________________________________________________________________________________

Использование MinION для исследования динамических структур в плазмидах у Salmonella, ответственных за мультилекарственную устойчивость
10.08.2018

ISCR1 — мобильный генетический элемент, ответственный за передачу генов устойчивости к антибиотикам. Генетическое разнообразие распределения и копийности ISCR1 в популяции бактерий, отражающее степень генетической пластичности, пока не изучено. Целью данного исследования было изучение плазмидной гетерогенности у Salmonella, используя ISCR1. Для выявления структур, несущих разное количество копий ISCR1-qnrB6, применялось нанопоровое секвенирование, а также другие технологии секвенирования.

Штамм Salmonella London Sa128 оказался позитивным по ISCR1-qnrB6 и обладал конъюгативной IncF-плазмидой pSa128, которая содержит интегрон 1 класса и ответственна за мультилекарственную устойчивость. Плазмида pSa128T из трансконъюганта длиннее по сравнению с оригинальной плазмидой pSa128, вероятно, из-за амплификации элемента ISCR1-qnrB6. Длинные риды, полученные с помощью нанопорового секвенирования, показали, что обе плазмиды из донора и трансконъюганта гетерогенны и содержат разное количество копий ISCR1-qnrB6 — 4 или 8. Подобная плазмидная гетерогенность в одном шатмме может рассматриваться как атипичный плазмидом.

Данная работа показала важность исследования нуклеотидной последовательности отдельных плазмид с помощью нанопорового секвенирования при изучении сложной структуры генов мультилекарственной устойчивости. Получаемые длинные риды позволяют выявлять плазмидную гетерогенность и полиморфизмы в этих генах среди представителей одного и того же штамма.

Resolution of dynamic MDR structures among the plasmidome of Salmonella using MinION single-molecule, long-read sequencing.
Ruichao Li Kaichao Chen Edward Wai Chi Chan Sheng Chen.
_____________________________________________________________________________________________________

tuberculosis-chest-x-ray.jpg

Изучение вирулентности и мультилекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis
10.08.2018

Каждый год регистрируется более 10 млн. случаев заболевания туберкулёзом, 600 тысяч из которых вызываются штаммами Mycobacterium tuberculosis, устойчивыми к лекарствам, таким как рифампицин или изониазид. Но большую опасность представляют штаммы с устойчивостью широкого спектра (XDR-штаммы). Механизм этой устойчивости и её передачи изучен недостаточно. Для его исследования используются методы секвенирования коротких ридов, которые не дают возможность анализа структурных вариаций, повторов и увеличения числа копий генов. Как правило, именно эти генетические особенности ответственны за вирулентность и передачу лекарственной устойчивости.

Учёные из Квинслендского университета (Австралия) использовали длинные риды, полученные с помощью нанопорового секвенирования, для исследования эволюционных механизмов, связанных с возникновением устойчивых штаммов M.tuberculosis. Было проведено т.н. секвенирование «методом дробовика» (шотган-секвенирование) XDR-штамма M.tuberculosis, ответственного за устойчивую к лекарствам эпидемию туберкулёза в западных областях Папуа-Новой Гвинеи. Для сборки генома использовалось ПО CANU, для отладки — ПО Racon. Была собрана полная последовательность кольцевого генома M.tuberculosis с 273-кратным покрытием и точностью 99,95%. Были идентифицированы все точечные полиморфизмы, связанные с лекарственной устойчивостью. Выявлены мутации в генах системы активного выведения, мембранного транспорта, биосинтеза клеточной стенки и вирулентности, которые могут фенотипически проявляться в лекарственной устойчивости M.tuberculosis и её передаче. Стоит отметить точное секвенирование GC-богатых областей и областей с повторами Pro-Glu и Pro-Pro-Glu. Именно такие области находятся в генах, связанных с вирулентностью и подавлением иммунитета.

Ряд исследованных генов ранее не был представлен в последовательностях ДНК M.tuberculosis, полученных с помощью коротких ридов — из-за большого количества GC или из-за делеций со сдвигом рамки считывания. Выявлены 2 области, отсутствующие в геномах европейских и американских штаммов.

https://nanoporetech.com/resource-centre/characterising-virulence-and-amr-mycobacterium-tuberculosis
_____________________________________________________________________________________________________

Быстрое секвенирование плазмид и выявление генов лекарственной устойчивости
10.08.2018

Большинство генов лекарственной устойчивости (устойчивости к антибиотикам) у бактерий находится в плазмидах. Однако традиционные технологии секвенирования недостаточно применимы из-за большого количества повторов в плазмидной ДНК.

Бактериальные плазмиды могут быть длиной до 100 тыс.п.н., что приводит к определённым проблемам при сборке в случае коротких ридов. Например, сложно дифференцировать геномную и плазмидную ДНК. А определение локализации генов антибиотикоустойчивости позволяет проводить эпидемиологические и эволюционные исследования и выявлять механизмы передачи устойчивости.

Исследователи из Национального института здравоохранения (США) использовали нанопоровое секвенирование для анализа плазмидной последовательности с целью быстрого выявления антибиотикоустойчивости. Сначала была секвенирована плазмида из хорошо изученного карбапенем-устойчивого изолята Klebsiella pneumoniae. Для приготовления библиотеки использовали набор на основе лигирования Oxford Nanopore. Сборка длинных ридов дала консенсусную последовательность с точностью 99%. После отладки (polishing) последовательности с помощью коротких ридов точность достигла 99,9%, однако для потенциального применения методики в клинической практике надо ограничиваться только нанопоровым секвенированием для сокращения времени исследования.

Все три плазмиды из изолята были отсеквенированы на 98%, все гены антибиотикоустойчивости идентифицированы. Чтобы ещё сократить время анализа, плазмидная ДНК из другого изолята Klebsiella pneumoniae была секвенирована с помощью набора для пробоподготовки на основе транспозазы Oxford Nanopore.

Данная стратегия позволяет идентифицировать все гены лекарственной устойчивости в микроорганизме менее чем за 6 часов. Достаточное покрытие для сборки генов антибиотикоустойчивости может быть получена с помощью 2000-5000 ридов, генерируемых за 20 минут.

Применение нанопорового секвенирования для построения профиля лекарственной устойчивости было также продемонстрировано учёными из Исследовательского института в Шеньжене (Китай). Они использовали бар-кодирование для мультиплексного секвенирования 12 штаммов бактерий с мультилекарственной устойчивостью. За 8 часов были получены риды, достаточные для полной сборки 20 плазмид (+ одна практически полная). Более того, одна плазмида длиной более 90 тыс. п.н. была секвенирована за одно прочтение и не требовала дальнейшей сборки. По результатам исследования получилось, что на одной проточной ячейке нанопорового секвенатора можно провести три запуска — 8, 10 и 12 часов. В сочетании с бар-кодированием это даёт возможность анализа 36 образцов на одной ячейке, что существенно снижает стоимость секвенирования плазмидной ДНК.

https://nanoporetech.com/resource-centre/rapid-sequencing-plasmids-and-resistance-gene-detection
_____________________________________________________________________________________________________

Понимание эволюционирования геномов ДНК-содержащих вирусов
10.08.2018

Учёные из университета штата Юта (США) использовали нанопоровое секвенирование для полногеномного анализа ДНК-содержащих вирусов с целью понимания эволюционных механизмов, помогающих вирусам в конфликте «хозяин-патоген». Как и другие вирусы с двунитевой ДНК, Orthopoxvirus vaccinia способен к быстрой адаптации несмотря на достаточно низкую скорость точечных мутаций (по сравнению с вирусами, содержащими однонитевую ДНК или РНК-вирусами). Ранее идентифицированы два белка — E3L и K3L, ингибирующие иммунный ответ хозяина. Делеция гена E3L и последующие пассажи вируса на культуре человеческих клеток приводят к появлению тандемных повторов из гена K3L. Также в гене K3L у вирусов с делецией E3L возникает точечная мутация H47R, приводящая к повышенной патогенности.

Технологии секвенирования, дающие короткие риды, позволяют идентифицировать эту точечную мутацию и секвенировать в целом локус K3L, но не дают возможность генотипировать полиморфизмы в тандемных повторах или охарактеризовать число копий гена. Технология нанопорового секвенирования позволяет охватить всю область генома, включающую повторы K3L. С её помощью выяснено, что число копий гена стабилизируется после 10 пассажа (до 15 копий), а полиморфизм H47R накапливается между 10 и 20 пассажами.

Предположено, что у вирусов с двунитевой ДНК имеет место накопление благоприятных мутаций за счёт их повторения в нескольких копиях генов.

https://nanoporetech.com/resource-centre/understanding-evolution-large-dna-viruses
_____________________________________________________________________________________________________

nanopore_anons.jpg

Быстрое секвенирование геномов РНК-содержащих вирусов
10.08.2018

Энтеровирусы относятся к группе вирусов, содержащих 1-нитевую РНК, и являются причиной миллионов случаев инфекций каждый год по всему земному шару. Для идентификации энтеровирусов в клинической практике наиболее часто используется ПЦР. Однако точечные мутации и рекомбинации у этих вирусрв встречаются очень часто и могут привести к ложнонегативным результатам ПЦР. Кроме того, данная техника требует культивирования вируса в течение 5-10 дней, что может быть критичным.

Группа учёных из Бернского университета (Швейцария) использовала прямое секвенирование РНК с помощью нанопоровой технологии для получения полной последовательности генома энтеровирусов из клинических образцов. С помощью вирусной кДНК из культуральных образцов можно получить консенсусную последовательность с точностью 98,8% уже через несколько минут после запуска секвенирования. Отладка последовательности с помощью программы Nanopolish повышает точность до 99,8%.

Прямое секвенирование РНК не требует обратной транскрипции и полезно в случаях, когда время является критическим фактором, например, при идентификации патогенов в клинической практике. Метод, разработанный исследователями из Бернского университета, позволяет получить результат с помощью прямого секвенирования РНК за 5 с половиной часов по сравнению с методом, включающим в себя обратную транскрипцию.

Прямое секвенирование РНК позволяет работать с клиническим материалом (стул), минуя стадию культивирования вируса. Хотя стандартная методика секвенирования рассчитана на 400 нг исходной РНК, удалось получить полную сборку генома вируса Коксаки со 140 нг стартового материала. Сборка была осуществлена на базе 11 ридов по 1000 нуклеотидов и более. В дальнейшем удалось получить практически полногеномную последовательность длиной 7208 нуклеотидов за 1 прочтение (не удалось прочитать 25 и 109 нуклеотидов на 5’- и 3’-концах, соответственно).

Таким образом, прямое секвенирование РНК даёт возможность быстро получить последовательность вирусного генома и избежать ошибок, связанных со стадиями обратной транскрипции и ПЦР.

https://nanoporetech.com/resource-centre/rapid-sequencing-rna-virus-genomes
_____________________________________________________________________________________________________

Сборка генома de novo и выявление лекарственной резистентности человеческого вируса герпес 1 типа (HHV-1)
10.08.2018

От 60 до 90% человеческой популяции инфицировано вирусом герпеса 1 типа. Для лечения герпеса существует множество препаратов, но ко всем из них у вируса имеются мутации, приводящие к устойчивости. HHV-1 содержит 2-нитевую ДНК длиной 152 тыс п.н., обладающую сложной структурой и богатую GC-областями. Это делает затруднительной сборку вирусного генома из коротких ридов.

Для изучения генома герпесвируса исследователи из Оксфордского университета (Великобритания) использовали как длинные риды, полученные с помощью нанопорового секвенирования, так и короткие. Было секвенировано 18 образцов, полученных от пациентов после антивирусной терапии. Сборка геномов производилась с помощью MIRA48 и LINKS49. Длина ридов, полученных при нанопоровом секвенировании, позволила объединить контиги, полученные из коротких ридов и прерываемые повторяющимися элементами. Таким образом, сборка осуществлялась из меньшего числа контигов большей длины.

Были охарактеризованы области генома герпесвируса со структурными вариациями — повторами, делециями и перестановками. Максимальный уровень нуклеотидных вариаций, связанных с лекарственной устойчивостью, обнаружен в гене UL23. Вероятно, эти мутации возникают в ходе терапии.

https://nanoporetech.com/resource-centre/de-novo-assembly-and-characterisation-drug-resistance-human...

Укажите кат. номер, наименование/фасовку и производителя той продукции, которая вам необходима:

Раскрыть анкету для отправки заказа

Другое лабораторное оборудование и принадлежности: автоматический титратор, биохимический анализатор, вакуумная печь для термообработки, весы производственные электронные.