Нанопоровое секвенирование Oxford Nanopore

Нанопоровое секвенирование (Nanopore sequencing) хотя и относится формально к NGS (секвенированию нового поколения), но фактически представляет собой следующий этап развития технологии секвенирования нуклеиновых кислот.

Все предыдущие технологии основаны на непрямом определении последовательности, то есть включают в себя стадию синтеза на ДНК-матрице, в процессе которого происходит детекция встраиваемых нуклеотидов-мономеров. При этом процесс секвенирования включает стадию пробоподготовки (ПЦР, мечение образца и т.д.).

При нанопоровом секвенировании происходит чтение нуклеотидного состава непосредственно анализируемой молекулы, что приводит к упрощению процесса, уменьшению временных затрат (в первую очередь, на анализ результатов) и снижению его стоимости. Принцип нанопорового секвенирования заключается в перемещении анализируемой молекулы через нанопору и регистрации изменения в окружающем электрическом поле в процессе движения молекулы.

В настоящий момент для секвенирования используются нанопоровые структуры биологического происхождения, но при этом разрабатываются искусственные нанопоры на основе диоксида кремния, а также гибридные молекулы.

Nanopore.jpg

Только Oxford Nanopore может это:
  • прямое чтение нуклеотидной последовательности цепей ДНК, РНК;
  • длина прочтения ограничена только длиной фрагмента;
  • наблюдение за ходом секвенирования в реальном времени дает возможность остановки процесса в любой момент при достаточном накоплении данных, при очевидных ошибках пробоподготовки или других сбоях в работе; интерпретацию сигналов (basecalling) и анализ данных можно проводить непосредственно в процессе секвенирования; простой алгоритм сборки полученных буквенных последовательностей;
  • секвенирование в полевых условиях и в мобильных лабораториях — нет необходимости доставлять образцы в специализированную лабораторию;
  • простая и быстрая подготовка библиотек — в течение 10 минут за 2 шага;
  • оборудование не требует специальных навыков для инсталляции и обслуживания.

В мае 2015 года компания Oxford Nanopore Technologies выпустила на рынок коммерческий секвенатор на основе нанопоровой технологии — MinION. Он представляет собой устройство карманного формата, подключаемое к USB-порту компьютера. В основе прибора — ячейка с 512 нанопорами, позволяющая провести одновременное секвенирование до 512 молекул ДНК или РНК (10-20 Гб информации). Длина прочтения может составлять до сотен тысяч пар нуклеотидов, а процесс пробоподготовки длится около 10 минут (с помощью набора Rapid Sequencing Kit). Сейчас на рынке доступны три секвенатора разной производительности.

1-2.jpg gridion-x5.png PromethION and compute 2996-29 (1).jpg
MinION
карманный секвенатор

  • Одна проточная ячейка
  • До 20 Гб данных
  • Подключается в ПК через USB 3.0
  • Многоразовая проточная ячейка,
    рассчитанная на 48 часов непрерывной
    работы — 512 каналов с нанопорами
GridION
настольный секвенатор

  • 5 проточных ячеек — 2560 активных
    каналов с нанопорами
  • До 100 Гб данных
  • Независимая работа каждой ячейки
  • Встроенный компьютер

PromethION
высокопроизводительный секвенатор

  • 48 проточных ячеек — 144 000 активных каналов с нанопорами
  • Для анализа больших массивов данных
  • Независимая работа каждой ячейки
  • Отдельно стоящий компьютер в комплекте

Другое оборудование Oxford Nanopore Technologies

Flongle — адаптер для MinION и GridION, позволяет работать с одноразовыми ячейками, применяется для задач, где требуется прямое прочтение более коротких ридов в режиме онлайн, — 128 каналов с нанопорами; для контроля качества, секвенирования ампликонов, малых геномов, таргетного секвенирования.

MinIT — карманный компьютер с предустановленными Linux OS и MinKNOW, предназначен для работы с секвенатором MinION как дополнение или альтернатива персональному компьютеру. Процесс также может контролироваться через bluetooth с ноутбука, планшета или смартфона.

VolTRAX v.2 — портативный прибор для автоматической подготовки библиотек.
  • Встроенный нагревательный блок и магниты;
  • наличие элемента Пельтье, позволяющего нагрев до +98 °С, и, следовательно, постановку полноценной ПЦР;
  • 15 загрузочных портов (в отличие от 8 у предыдущей версии прибора), что позволяет работу с любым набором для пробопоготовки;
  • усовершенствованный механизм перемешивания;
  • встроенный детектор флуоресценции для количественного анализа нуклеиновых кислот;
  • минимальные затраты на расходные материалы и реагенты;
  • подготовка библиотек вне лаборатории;
  • работа от ПК через USB.

SmidgION — разрабатываемое в данный момент устройство для секвенирования, подключаемое к смартфону или другому мобильному устройству. Предназначено для работы в полевых условиях.
11.JPG 12.JPG voltraxv2.jpg SmidgION.jpg
Наборы для подготовки библиотек ДНК без стадии ПЦР:

#LSK108 Набор Ligation Sequencing Kit 1D, 6 реакций. Для наибольшей производительности, пробоподготовка 60 мин, 1000 нг дцДНК, фрагментация опционально, длина рида равна длине фрагментов ДНК.

#RAD004 Набор Rapid Sequencing Kit, 6 реакций. Простая и быстрая пробоподготовка, 10 мин, 400 нг высокомолекулярной геномной ДНК (> 30 т. п.о.), фрагментация транспозазой, длина фрагмента случайная.

#LSK308 Набор 1D2 Sequencing Kit, 6 реакций. Наибольшая точность прочтения, пробоподготовка 80 мин, 1000 нг ДНК, фрагментация опционально, длина рида равна длине фрагментов ДНК, чтение обеих цепей двухцепочной ДНК.

Наборы для подготовки библиотек РНК:

#RNA001 Набор Direct RNA Seqeuncing Kit, 3 реакции. Прямое секвенирование молекул РНК с сохранением модификаций оснований, пробоподготовка 115 мин, 500 нг РНК (поли А+), длина рида равна длине фрагментов РНК, без стадии ПЦР, обратная транскрипция опционально.

#PCS108 Набор cDNA-PCR Sequencing Kit, 6 реакций. Секвенирование полноразмерных транскриптов с высокой производимостью, пробоподготовка 115 мин, 50 нг РНК (поли А+), длина рида преимущественно равна длине полноразмерных кДНК, со стадией ПЦР и обратной транскрипцией.

#DCS108 Набор Direct cDNA Sequencing Kit, 6 реакций. Секвенирование полноразмерных транскриптов без стадии ПЦР, пробоподготовка 210 мин, 250 нг РНК (поли А+), длина рида равна длине фрагментов кДНК, без стадии ПЦР, с обратной транскрипцией.

Другие наборы для подготовки библиотек:
  • наборы, включающие стадию ПЦР, при небольших количествах выделенной ДНК;
  • наборы для мультиплексирования, для снижения затрат на секвенирование (баркодирование);
  • наборы для специфических применений — анализ 16S, устойчивость к антибиотикам, идентификации бактерий, грибов, архей, вирусов, секвенирование экзома;
  • наборы для баркодирования.

Basecalling и интерпретация данных

При прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через нанопору регистрируются данные об изменении электрического тока, на основании этих данных можно интерпретировать не только последовательность нуклеотидов, но и их различные модификации. Интерпретация (Basecalling) может происходить онлайн с помощью встроенной программы MinKNOW или оффлайн с программой Albacore. Платформа EPI2ME — готовое решение от подготовки библиотек до получения результата для некоторых применений (баркодирование, анализ 16S, устойчивость к антибиотикам, идентификации бактерий, грибов, архей, вирусов (WIMP – What is in my pot), секвенирование экзома, сопоставление полученных сиквенсов с имеющимися в базах данных (GenBank). В Nanopore Community доступны различные решения для анализа полученных данных — Variant calling, de novo assembly и многое другое. Данные, полученные в процессе секвенирования, записываются в виде файлов в формате fast5 или fastq и пригодны для анализа с помощью инструментов в Nanopore Community или платформы EPI2ME.


Также компания Диаэм предлагает секвенаторы:

Укажите кат. номер, наименование/фасовку и производителя той продукции, которая вам необходима:

Раскрыть анкету для отправки заказа

Другое лабораторное оборудование и принадлежности: анализатор качества молока, анализатор со2, анаэростат, бидистилляторы лабораторные.