Генетические методы HLA-типирования

HLA — аббревиатура, расшифровываемая как Human Leucocyte Antigen, человеческие лейкоцитарные антигены. Этим термином обычно называют комплекс генов, кодирующих белки клеточной поверхности, ответственные за регуляцию деятельности иммунной системы. Другое название этих белков — главный комплекс гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex, MHC). Каждый человек обладает индивидуальным набором HLA-белков, которые выполняют функцию распознавания организмом клеток по типу «свой-чужой» и, в случае необходимости, помогают запустить иммунный ответ. Белки МНС подразделяются на 2 класса: к первому относятся HLA-A, B и С, ко второму HLA-DP, DQ, DR, DM и DO.

Выявление разновидностей HLA называется HLA-типированием. HLA-типирование не является рутинным обследованием, но в ряде случаев оно необходимо. В первую очередь, HLA-типирование играет ключевую роль при трансплантации. Успешность трансплантации напрямую зависит от совместимости клеток донора и реципиента по HLA, главным образом по HLA-DR. Поэтому HLA-типирование обязательно при создании банков костного мозга и пуповинной крови.

HLA-типирование необходимо при диагностике причин невынашивания беременности. Некоторые сочетания HLA-генотипов супругов являются несовместимыми, и для сохранения плода необходима иммунотерапия.

Кроме того, ряд HLA-генотипов cвязан с повышенным риском аутоиммунных заболеваний, онкологии или повышенной восприимчивостью (или, наоборот, устойчивостью) к инфекционным болезням, таким, как гепатит С.

Методы HLA-типирования можно разделить на 2 группы: иммунологические (серологические) и генетические. Серологические методы менее затратные, но достаточно трудоёмки, и точность этих методов относительно невысока. Поэтому генетические методы становятся всё более распространёнными. 

 HLA-1.png  
В настоящее время распространены следующие генетические методы: 
  • SSP (метод специфических праймеров, sequence-specific primers);
  • SSO (метод специфических олигонуклеотидов, sequence-specific oligonucleotides);
  • секвенирование.

SSP (метод специфических праймеров, sequence-specific primers)

 

SSO (метод специфических олигонуклеотидов,  sequence-specific oligonucleotides)

 HLA 2.png   HLA-3.png 
В основе метода — ПЦР с праймерами, специфичными к определённому варианту или группе вариантов, а затем продукты амплификации анализируются электрофорезом. Метод позволяет достаточно быстро произвести типирование, но могут быть ошибки. Также может потребоваться много анализов для получения точного генотипа.   В основе метода — гибридизация ДНК со специфическими олигонуклеотидами, меченными по технологии xMap. Чипы после гибридизации анализируются на мультиплексном проточном анализаторе (например, Bio-Plex 3D). Эти методы позволяют провести типирование достаточно быстро, но не со 100% точностью. Недостаток этих методов — невозможность точно типировать вариант с нуля. За один прием можно или определить HLA-тип в каких-то рамках, или уточнить тип на основании имеющихся данных. Для получения полного генотипа потребуется множество анализов.

Секвенирование

Секвенирование по Сэнгеру (SBT-typing). Так как гены главного комплекса гистосовместимости (MHC, Major Histocompatibility Complex) имеют значительную протяжённость, то секвенируются только вариабельные области генов HLA (отдельные экзоны). Это точный и быстрый метод, но низкая производительность и недостаточно полное типирование делают его пригодным только для уточнения HLA-типа. Также возможны ошибки при анализе гетерозигот.
NGS. С помощью полногеномного секвенирования можно получить полную последовательность всех генов главного комплекса гистосовместимости. Основные трудности — специфическая амплификация области генома, содержащей эти гены, и правильная интерпретация результатов секвенирования. Комплекты для HLA-типирования Holotype HLA, Omixon успешно решают обе задачи. Продукт включает в себя набор реагентов для пробоподготовки, в том числе уникальные праймеры для специфической амплификации до 11 локусов HLA, а также программное обеспечение HLA Twin для интерпретации результатов секвенирования.

Holotype HLA предназначен для секвенирования на платформе Illumina и обеспечивает высокую производительность — за один прогон на секвенаторе MiSeq можно проанализировать от 4 до 96 образцов по 11 локусам, до 192 образцов по 7 локусам или до 288 образцов по 5 локусам. Полное и равномерное покрытие всей области генов главного комплекса гистосовместимости сочетается с балансом между аллелями в одном локусе, между локусами в одном образце и между образцами в одном анализируемом пуле ДНК. Достоверность интерпретации результатов обеспечивается двумя независимыми алгоритмами консенсусного и статистического генотипирования. Также программное обеспечение HLA Twin даёт возможность выявления нулевых и новых аллелей генов МНС. Ещё одно преимущество — HLA Twin может использоваться на платформах Windows, OS X и Linux.

Кроме Holotype HLA, Omixon предлагает другие продукты: наборы Monotype HLA и программное обеспечение HLA Explore. Наборы Monotype HLA предназначены для генотипирования отдельных локусов МНС, связанных с повышенным риском некоторых заболеваний. Например, набор Monotype HLA-DQ предназначен для выявления аллелей риска целиакии и нарколепсии. Возможен также дизайн праймеров для анализа любых локусов по заказу исследователя. 
       hla 4.jpg
   HLA 5.jpg
Программное обеспечение HLA Explore предназначено для HLA-генотипирования на основе данных секвенирования, полученных на различных платформах — Illumina, Ion Torrent, PacBio и Nanopore. Для интерпретации могут использоваться результаты таргетного, экзомного или полногеномного секвенирования.

HLA 6.jpg
Наборы Holotype HLA предназначены для типирования генов HLA I класса по локусам HLA-A, B, С и II класса HLA- DQA1/B1, DRB1/B3/B4/B5, DPA1/B1.

Продукт доступен в двух форматах – для одновременного анализа 24 или 96 образцов по 5, 7 или 11 локусам HLA.

Планшеты, входящие в состав набора, для удобства по желанию клиента могут идти в трех конфигурациях – A, B, C. Это подразумевает, что каждый последующий планшет продолжает нумерацию предыдущего.

Таким образом, с 3-мя наборами 96/5 можно проанализировать до 288 образцов, имея планшеты с тремя конфигурациями.

Все наборы Holotype HLA соответствуют стандарту ISO-13485 / GMP. Для продуктов, анализирующих одновременно 7 и 11 локусов HLA, возможна маркировка CE-IVD, подтверждающая соответствие требованиям ЕС.
 HLA.png  
Тип набора  Локусы Количество анализируемых образцов 
Набор из 5 локусов  A, B, C, DRB1, DQB1 96
Набор из 7 локусов A, B, C, DRB1, DQA1/B1, DPB1 24/96
Набор из 11 локусов A, B, C, DRB1/B3/B4/B5, DQA1/B1, DPA1/B1 24/96

Наборы Monotype HLA предназначены для типирования отдельных локусов HLA-B и DQ. Они используются, в основном, для выявления отдельных заболеваний, исследований в области популяционной генетики и тестирования чувствительности к лекарственным средствам.

Так же, как и Holotype HLA, Monotype HLA доступны в 2 форматах – для одновременного анализа 24 или 96 образцов в трех конфигурациях. 

Состав продуктов Holotype HLA и Monotype HLA:
  • праймеры;
  • набор реагентов для пробоподготовки и специфической амплификации 24 или 96 образцов;
  • 96-луночный планшет;
  • программное обеспечение HLA Twin.

Программное обеспечение HLA Twin защищено ключами и поставляется бесплатно для пользователя при покупке набора.

В случае использования набора Monotype HLA с самостоятельно сконструированными праймерами Omixon предлагает к использованию специально разработанное ПО HLA Explore.

 hla mono.png
Развернуть описание # HLA 24/5
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 96/5 A
96 образцов  Omixon
5 760,00 евро
   
Развернуть описание # HLA 96/5 B
96 образцов  Omixon
5 760,00 евро
   
Развернуть описание # HLA 24/7
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 24/7 CE
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 96/7 A
96 образцов  Omixon
5 760,00 евро
   
Развернуть описание # HLA 96/7 B
96 образцов  Omixon
5 760,00 евро
   
Развернуть описание # HLA 96/7 C
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 96/7 CE
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 24/11
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 24/11 CE
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 96/11 A
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 96/11 B
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 96/11 C
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA 96/11 CE
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA-B 24
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA-B 96
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA-DQ 24
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA-DQ 96
96 образцов  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA-AB 24
24 образца  Omixon
по запросу
   
Развернуть описание # HLA-AB 96
96 образцов  Omixon
по запросу